HPLC测定肉苁蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量

2015-03-15田玉彪杨广安黄维杰向仕珍王慧娟贵州大学药学院贵州贵阳550025贵州省中药民族药创制工程中心贵州贵阳550025贵州省药食同源植物资源研究开发中心贵州贵阳550025

安徽农业科学 2015年33期

田玉彪，杨广安,2,3，黄维杰，向仕珍，王慧娟,2,3，周英,2,3*　(.贵州大学药学院，贵州贵阳 550025；2.贵州省中药民族药创制工程中心，贵州贵阳 550025；3.贵州省药食同源植物资源研究开发中心，贵州贵阳 550025)

田玉彪1，杨广安1,2,3，黄维杰1，向仕珍1，王慧娟1,2,3，周英1,2,3*(1.贵州大学药学院，贵州贵阳 550025；2.贵州省中药民族药创制工程中心，贵州贵阳 550025；3.贵州省药食同源植物资源研究开发中心，贵州贵阳 550025)

摘要[目的]建立高效液相色谱法同时测定肉苁蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量。[方法]采用安捷伦1260高效液相色谱仪和Waters C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱，流速1 ml/min，检测波长330 nm，柱温30 ℃。[结果]松果菊苷和毛蕊花糖苷进样量分别在0.40～4.00、0.44～44.00 μg范围内均与峰面积呈良好线性关系，平均回收率分别为97.4%和101.3%，RSD分别为1.70%、1.52%。[结论]该方法简单可行、重现性好、精密度高、结果可靠，可用于同时测定肉苁蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量。

关键词高效液相色谱法；肉苁蓉微粉；松果菊苷；毛蕊花糖苷；含量测定

Determination on the Content of Echinacoside and Acteoside fromHerbaCistancheMicro Powder by HPLC

TIAN Yu-biao1,YANG Guang-an1,2,3,HUANG Wei-jie1,ZHOU Ying1,2,3*et al(1.College of Pharmacy,Guizhou University, Guiyang,Guizhou 550025;2.Guizhou Engineering Center for innovative Traditional Chinese Medicine and Ethnic Medicine, Guiyang,Guizhou 550025;3.Guizhou Research and Development Center of Medicinal and Edible Plant Resources, Guiyang,Guizhou 550025)

Abstract[Objective] The research aimed to establish the HPLC method for determining the content of echinacoside and acteoside fromHerbaCistanchemicro powder.[Method]Agilent 1260 high performance liquid chromatograph and waters C18column(5 μm,4.6 mm×250 mm) were adopted.The mobile phase was mixture of methanol and 0.1% formic acid water solution gradient elution.The flow rate was 1 ml/min,the detection wavelength was 330 nm,the column temperature was 30 ℃.[Result]The linear ranges of echinacoside and acteoside were 0.40-4.00 and 0.44-44.00 μg respectively,the average recoveries were 97.4%(RSD=1.7%)and 101.3%(RSD=1.52%)respectively,RSDwere 1.70% and 1.52% respectively.[Conclusion] The method was simple and feasible, good reproducibility, high precision and reliable results.It can be used as quantitative determination for the content of echinacoside and acteoside fromHerbaCistanchemicro powder.

Key wordHPLC;HerbaCistanche;Echinacoside；Acteoside;Content determination

肉苁蓉(HerbaCistanche)为列当科(Oroban-chaceae)植物肉苁蓉(CistanchedeserticolaMa)的带鳞片的干燥肉质茎,又名苁蓉、大芸、金笋、地精，始载于《神农本草经》列为上品。其味甘、咸，性温，归肾、大肠经，具有补肾阳、益精血、润肠通便功能[1]。目前，肉苁蓉已分离出多种类型的物质,主要可分为苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类、多糖、生物碱等[2-3]。药理试验证实，肉苁蓉中的苯乙醇总苷,类叶升麻苷均具有促性激素样、雄激素样及增强小鼠非特异性免疫功能等作用[4-6]。

在中药浸出物制备过程中，合适粒度使得中药指标性成分最大限度的溶出,提高其释放速度和利用率,中药有效成分的浸出与扩散面积(粉碎度)和扩散时间有关[7-9]。在肉苁蓉含量测定方面,张思巨等[10]建立HPLC同时测定肉苁蓉药材中松果菊苷和毛蕊花糖苷含量的方法,并测定野生药材的含量；王长林等[11]采用HPLC法分析不同生长周期、不同部位管花肉苁蓉中松果菊苷的指纹图谱。目前，对肉苁蓉微粉的研究较少，该试验对肉苁蓉药材进行微粉化处理，以其质量控制作为研究目标，参照2010版《中国药典》，采用HPLC同时测定肉苁蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量，以期为中药材生产加工节省中药资源、减少生产环节、降低设备投资、缩短生产周期。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器。安捷伦1260高效液相色谱仪和Waters C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，G1311C输液泵，G1316A柱温箱，G1329自动进样器，G1314F-VWD紫外检测器，Chemstation色谱工作站。FA2004 型电子分析天平( 上海良平仪器有限公司) ，超微粉碎机(济南倍力粉技术工程有限公司)，超声仪(KQ-500型，昆山市超声仪器有限公司)等。

1.1.2药材及试剂。收集到6批肉苁蓉样品，经贵州大学贵州省中药民族药创制工程中心鉴定为肉苁蓉，超微粉碎机粉碎，过400目筛，放置干燥器备用。松果菊苷(批号111670-201304)及毛蕊花糖苷(批号111503-201411)对照品，均购于中国食品药品检定研究院，甲醇(ACS,Reag.Ph Eur)，自制高纯水。

1.2方法

1.2.1对照品溶液的制备。取松果菊苷及毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇配制成每1 ml含松果菊苷0.20 mg和毛蕊花糖苷0.22 mg的混合对照品溶液，避光，4 ℃环境储存备用。

1.2.2供试品溶液的制备。取供试品粉末(过400目筛)约1 g，精密称定，置100 ml棕色容量瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，密塞，摇匀，称定重量，浸泡30 min，超声处理40 min(功率250 W，频率35 kHz)，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

1.2.3色谱条件。采用安捷伦1260高效液相色谱仪和Waters C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，G1314F-VWD紫外检测器的检测波长为330 nm；流动相为甲醇与0.1%甲酸水溶液，按不同比例混合(0～17 min：26.5∶73.5,17～25 min：29.5∶70.5,25～40 min：29.5∶70.5,)；进样量10 μl，流速1 ml/min，柱温30 ℃，理论板数按松果菊苷、毛蕊花糖苷峰计算应不低于3 000。

1.2.4方法学考察。

1.2.4.1线性关系考察。精密吸取毛蕊花糖苷及松果菊苷对照品储备液2、4、6、8、10、20 μl，经0.45 μm的微孔滤膜过滤后，在“1.2.3”色谱条件下测定峰面积，以对照品溶液浓度为横坐标x、峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线并进行回归分析。

1.2.4.2精密度试验。精密吸取毛蕊花糖苷及松果菊苷对照品储备液10 μl，按“1.2.3”色谱条件连续进样6次，以峰面积计算毛蕊花糖苷及松果菊苷的RSD。

1.2.4.3重复性试验。按“1.2.2”方法制备供试溶液，经0.45 μm的微孔滤膜过滤后，精密吸取供试溶液10 μl，按“1.2.3”色谱条件连续进样6次，以峰面积计算毛蕊花糖苷及松果菊苷的RSD。

1.2.4.4稳定性试验。按“1.2.2”方法制备供试溶液,经0.45 μm的微孔滤膜过滤后，每隔4 h精密吸取供试溶液10 μl，按“1.2.3”色谱条件分别于0、4、8、12、20、24 h连续进样6次，以峰面积计算毛蕊花糖苷及松果菊苷的RSD。

1.2.4.5回收率试验。精密称取6份已知含量的样品各0.5 g，分别精密加毛蕊花糖苷及松果菊苷标准溶液适量，按“1.2.2”方法制备溶液，按“1.2.3”色谱条件进样分析，测定峰面积，计算各成分的量及回收率。

1.2.5样品含量测定。精密称取6批次肉苁蓉样品各3份，每份1 g，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，按“1.2.3”色谱条件进样分析，测定峰面积，计算毛蕊花糖苷及松果菊苷的含量，数据的表示方法为x±SD。

2结果与分析

2.1方法学考察

2.1.1线性关系。按“1.2.4.1”方法操作，以对照品溶液浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果显示松果菊苷和毛蕊花糖苷的线性回归方程分别为y=1 312.3x+24.944(R2=1.000 0)、y=1 554.0x+33.02(R2=0.999 9)，表明松果菊苷和毛蕊花糖苷分别在0.40～4.00、0.44～4.40 μg的范围内呈良好的线性关系。

2.1.2精密度试验。按“1.2.4.2”方法操作，计算得毛蕊花糖苷和松果菊苷的RSD分别为0.29%和0.49%，表明仪器精密度试验合格。

2.1.3重复性试验。按“1.2.4.3”方法操作，测得毛蕊花糖苷和松果菊苷的RSD分别为0.82%和0.52%，表明该方法重复性良好。

2.1.4稳定性试验。按“1.2.4.4”方法操作，根据峰面积计算毛蕊花糖苷及松果菊苷的RSD分别为1.75%和1.90%,表明供试液在24 h内稳定性良好。

2.1.5回收率试验。由表1可见，该方法测定肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的平均回收率分别为97.4%、101.3%，RSD分别为1.70%、1.52%，表明该方法准确、可靠，可用于肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量测定。

表1　肉苁蓉中松果菊苷及毛蕊花糖苷回收率

2.2不同批次肉苁蓉微粉中松果菊苷及毛蕊花糖苷的含量由表2可知，不同收集批次肉苁蓉中松果菊苷含量最大的为17.8 mg/g、最小的为13.6 mg/g，毛蕊花糖苷含量最大的为12.3 mg/g、最小的为8.2 mg/g，说明不同收集批次肉苁蓉中松果菊苷及毛蕊花糖苷的含量有较大的差异。可见，肉苁蓉药材质量因植株个体情况存在明显的差异。从图1可看出，松果菊苷及毛蕊花糖苷的分离度均较好，在“1.2.3”色谱条件下，样品分离良好；混合标准品储备液中松果菊苷及毛蕊花糖苷的保留时间分别为17.44、34.84 min，在样品溶液色谱峰中松果菊苷及毛蕊花糖苷的保留时间分别为17.43、35.04 min。由于受运行时间或冲洗时间的影响，样品松果菊苷及毛蕊花糖苷的保留时间与标准品不完全一致，但在误差允许的范围内。

3讨论

近年对肉苁蓉的研究报道文献较多，但对肉苁蓉微粉化的研究报道甚少，该试验参照2010版《中国药典》及相关文献对其微粉化进行研究，以肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷为考察指标，采用高效液相色谱法(HPLC)测定其微粉化中松果菊苷和毛蕊花糖苷含量及其稳定性考察。结果表明，松果菊苷和毛蕊花糖苷进样量分别在0.40~4.00、0.44~44.00 μg范围内均与峰面积呈良好线性关系，平均回收率分别为97.4%和101.3%，RSD分别为1.70%、1.52%。该方法简单可行、重现性好、精密度高、结果可靠，可用于同时测定肉苁蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量。

表2不同收集批次肉苁蓉微粉中松果菊苷及毛蕊花糖苷含量测定结果

该试验中发现肉苁蓉中毛蕊花糖苷在常温下放置容易变质，配制好的储备液应尽快使用，同时于阴凉避光处储存。

通过对原生药材进行超细粉碎,可以得到更加适合于机体吸收、利用的微粉药材,从而大大提高原生药材的生物利用度和其治疗效果，因此用微粉提高肉苁蓉的利用率是一个行而有效的办法[12]，肉苁蓉微粉化研究为其微粉化制剂的开发奠定理论基础，也为进一步开发利用肉苁蓉资源以及深入挖掘其在食品、医学领域的应用提供了一定的参考价值，对企业中药材加工有一定的指导意义。

参考文献

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