王蔚昕，张瑞瑛，黄 星

（1.公安部物证鉴定中心，北京100038；2.首都师范大学，北京100037）

Y-羟基丁酸（GHB）具有强烈的镇静作用和健忘效果，并能刺激人体分泌荷尔蒙素、增加欣快感，且其无色无味，很容易加入到饮料中而不被发觉，因此，GHB 往往与性犯罪联系在一起，在娱乐场所被滥用[1,2]。GHB 目前在美国已被作为“俱乐部药物”实行管制，在新加坡列为A 类管制药物，我国已经于2007年将GHB 列为一类精神管制药物，可见GHB 的滥用已引起各国的高度重视并给予了严格的管控。我国贩卖GHB 或利用GHB 作为迷奸药进行抢劫强奸的案件呈逐年上升趋势，对社会造成的危害日渐严重，GHB 的实验室检验要求也随之增多。目前，国内外法庭科学实验室多采用将GHB 衍生化后用GC/MS 进行定性分析，但缺少液态检材基质及前体物质Y-丁内酯（GBL）对GHB 定性结果影响的系统研究。本研究基于柱前衍生化GC/MS 分析方法，考察了pH 值对GHB 稳定性与提取效率的影响、衍生化条件及复杂液态基质对GHB 色谱行为的影响、前体物质GBL 对GHB 检验结果的影响，优化了样品前处理方法及色谱条件。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

气相色谱/ 质谱联用仪（GC/MS，岛津QP-2010）,配有电子轰击源。

1mg·mL-1GHB 标准品甲醇液（Cerilliant）；衍生化试剂双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA），含有1%三甲基硅烷（TMCS）（Supelco）；乙腈（Merck）为高效液相色谱级；乙酸乙酯、丙酮、HCl、NaCl、磷酸盐等均为国产分析纯。4 种饮料样品购于当地超市，分别为碳酸饮料-雪碧、果汁饮料-“统一”牌橙汁、茶饮料-“统一”牌绿茶和酒精饮料-“燕京”罐装10P 特制啤酒。

1.2 样品前处理方法

分别取添加了GHB 标准物质的饮料样品500μL 置于具塞离心试管中，测定样品溶液pH值。

若pH 值≥6，直接加入乙酸乙酯2mL，涡旋混合5min，3000r·min-1离心分离3min，移除乙酸乙酯层溶液，再用乙酸乙酯2mL 重复提取一次，移除乙酸乙酯层溶液。在水层溶液中加入0.1N HCl 适量并混匀，将其pH 值调至2～3，加入乙酸乙酯2mL，涡旋混合5min，3000r·min-1离心分离5min，移取乙酸乙酯层溶液；再加入乙酸乙酯2mL 重复提取一次，移取乙酸乙酯层溶液，合并两次提取液至另一具塞锥形底离心试管中，于35℃空气流下挥干。残留物中加入30μL 乙腈和20μL BSTFA（过量衍生化试剂），70℃下反应10min，冷却至室温，再加入乙酸乙酯0.5mL，待测定。

若pH 值＜6，向样品溶液中加入0.1N NaOH 溶液适量并混匀，调节pH 值至6～7，其余操作同前所述。

1.3 色谱-质谱条件

色谱条件:色谱柱为DB-5 MS 毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；载气为He，纯度≥99.999%；流速1.0mL·min-1；分流进样，分流比10∶1；初始柱温60℃，保持2min，以30℃·min-1程序升温至280℃，保持10min; 进样口温度250℃；溶剂延迟时间4.0min。

质谱条件:离子源温度230℃；接口温度280℃;扫描范围m/z50～600；数据采集模式为全扫描方式。

2 结果与讨论

2.1 不同基质中添加GHB 标准物质（10ppm）的BSTFA 衍生化GC/MS 分析结果

图1 不同液态基质中GHB 标准物质（10ppm）的衍生化GC/MS TIC 图Fig.1 The TIC of GHB Std in different liquid matrix derivatized with BSTFA analyzed by GC/MS

图2 GHB BSTFA 衍生物的质谱图Fig.2 The mass spetrum of GHB Std derivatized with BSTFA analyzed by GC/MS

由图1、2 可见，GHB BSTFA 衍生物保留时间为6.31min，特征碎片离子（m/z）为233、147、73。碎片离子（m/z）147为BSTFA（含有1%三甲基硅烷）衍生物表征衍生化试剂的典型碎片离子；而碎片离子（m/z）233 包含了GHB 自身结构信息，最具有特征性，其结构见图3。

图3 m/z 为233 的GHB BSTFA 衍生物碎片离子结构图Fig.3 The structure of the fragment ion at 233 m/z from GHB Std derivatized with BSTFA analyzed by GC/MS

2.2 方法检出限

对简单液态基质中GHB 的分析，检出限可以达到50ng·mL-1；对各种饮料等复杂液态基质中GHB 的分析，检出限可以达到100ng·mL-1。由于各种饮料、饮品成分复杂，均含有与GHB 性质近似的小分子有机酸类物质，比如苯甲酸、苹果酸、柠檬酸等。该类物质与GHB pKa 值接近、溶解性相似，通过调整pH 值后用特定有机溶剂萃取分离的方法很难去除。在提取过程中，该类物质竞争性地抑制了GHB 从水相向有机相的转移，降低了GHB BSTFA衍生物的产率，使分析方法检出限有所升高。

2.3 实验条件的优化

2.3.1 复杂基质样品经过简单纯化的必要性 各种类型饮品中都含有一定量的弱极性脂溶性成分（有机酸、生物碱、多酚类化合物），能够被乙酸乙酯从水相中萃取出来。当其含量较高时，就会竞争性地抑制GHB 成分从水相向有机相的转移，显著降低GHB 的提取效率。本研究综合考虑GHB 的PKa值及其在不同pH 值下游离态与离子态的互化特性，通过在适当pH 值下用有机溶剂少量多次萃取的方法，去除了部分碱性、中性、弱酸性脂溶性杂质成分，从而达到了有效富集目标成分的目的。

图4 纯化前后，几种饮料基质中GHB 标准物质（1×10-6）的衍生化GC/MS 233（m/z）提取离子色谱图Fig.4 The EIC of ion at 233 m/z from GHB Std（1ppm）in several kinds of beverage derivatized with BSTFA analyzed by GC/MS with or without purification（a:without purification; b:with purification）

由图4 可知，简单纯化过程可以有效提高GHB的提取效率，降低复杂基质中GHB 分析的检测限。

2.3.2 提取方法中pH 值的选择 GHB 为小分子有机酸，只有以游离态存在时，才能被有机相从水相中萃取出来。因此，为了满足准确定性的要求，一方面，最佳的提取pH 值要能使检材中GHB 的盐型最大程度上转化为游离态并且稳定在游离态，另一方面，检材中原有的GBL 结构在该pH 值下也能保持稳定，不发生向GHB 的转化。本研究通过实验发现，GBL 与GHB 游离态均在弱酸性条件下比较稳定，当提取pH 值为2～3 时，GHB 的提取回收率最高。

2.3.3 衍生化试剂用量对实验结果的影响 一方面，各种类型饮料饮品成分复杂，在对饮料基质中GHB 衍生物进行检测时，必须考虑基质中其它组分对衍生化试剂的消耗。如果衍生化试剂用量过小，亲衍生化试剂物质的优先发生反应可能导致GHB衍生物产率降低。另一反面，如果衍生化试剂用量过大，未反应试剂剩余过多，对色谱柱损害又会较大。不同类型饮料所含物质成分差异较大，酒精饮料含有醇类与少量有机酸类物质，碳酸、果汁饮料中含有较多小分子有机酸类物质，茶饮料中含有较多茶多酚类物质（包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等），因此，其主要成分对BSTFA 的竞争性消耗强弱不同。本研究通过实验发现衍生化试剂用量为20μL、浓度为40%时，基本同时满足几种不同类型饮料样品的分析需求，使其检测限均能达到100×10-9，且对色谱柱损害较小。

图5 不同衍生化试剂用量下，几种饮料基质中GHB 标准物质（1×10-6）的衍生化GC/MS 233（m/z）提取离子色谱图Fig.5 The EIC of ion at 233 m/z from GHB Std（1ppm）in several kinds of beverage derivatized with BSTFA analyzed by GC/MS using different amount of derivatization reagent（a;10μL; b: 20μL）

由图5 可知，碳酸饮料、茶饮料自身所含物质成分对衍生化试剂BSTFA 的竞争性消耗明显强于酒精饮料，衍生化试剂用量对其所含GHB 成分的检测结果有显著影响。

2.3.4 上机检测前衍生化终产物稀释的必要性 衍生化反应结束后，未反应的衍生化试剂如果浓度过大会造成色谱柱流失严重、柱效降低，对色谱柱损害较大。为了降低柱流失，在实验中常采用在衍生化反应结束后挥干衍生化试剂、溶剂，用特定有机溶剂重新溶解的方式。但是本研究通过实验证明，GHB BSTFA 衍生物的挥发性很强，会随衍生化试剂一同被挥发掉（图6-a），挥干重溶对GHB BSTFA 衍生物的检测分析不可行。因此，为了降低衍生化副产物和杂质对色谱柱和检测器的不利影响，在进行GC/MS分析前要对待测样品进行适当稀释（图6-b）。

图6 进样前对衍生化终产物采用不同处理方式，纯水中GHB 标准物质（1×10-6）的衍生化GC/MS 233（m/z）提取离子色谱图Fig.6 The EIC of ion at 233 m/z from GHB Std（1ppm）in water derivatized with BSTFA analyzed by GC/MS processing the derivative in different ways before injection（a;dissolved again with EAC after the evaporation of original solvent; b: diluted with EAC direct）

2.3.5 色谱条件中溶剂延迟时间的设定 在实验过程中发现，溶剂延迟时间的设定对检测结果有一定影响。实验表明，适当延长溶剂延迟时间可以有效降低基质中含量较高的弱保留组分及其衍生化副产物对目标物检出的干扰，提高目标组分的检测灵敏度。对几种不同类型饮料样品分别进行了考察，最终将溶剂延迟时间设为4.0min，基本满足了不同类型复杂基质样品的检验需要。

［1］Elsohly MA,Salamone SJ.J.Anal.Toxicol,1999,23:141-146.

［2］Lebeau M,AndolloM,Hearn WL.J.Forensic Sci.，1999，44:227-230.