徐碧林，申甜，喻明，汪红平，章志建，朱近悦

(上海市普陀区中心医院，上海200062)

2型糖尿病(T2DM)以胰岛素抵抗(IR)和胰岛β细胞功能受损为特征。研究表明，高水平的β细胞凋亡是胰岛功能受损的主要原因［1］。近年来研究发现，游离脂肪酸(FFA)不仅参与IR的发生，也损害β细胞胰岛素分泌功能，导致β细胞凋亡。白藜芦醇(Res)属于一种酚类植物抗毒素，是天然的抗氧化剂和自由基廓清剂，主要存在于各种红葡萄果实和红葡萄酒中。研究表明，Res具有明显降糖作用，但具体机制尚未完全明了。2014年1～6月，本研究用FFA酸棕榈酸处理β细胞后，观察不同浓度的Res对胰岛β细胞凋亡的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠胰岛素瘤细胞(β-TC-6细胞株)购自中国科学院上海细胞生物学研究所，Res、棕榈酸购自上海安谱生物科技有限公司;DMEM高糖培养基(Hyclone公司)，优质胎牛血清(Biowest南美血源); AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒(北北京宝赛生物技术有限公司)，5%二氧化碳(CO2)细胞培养箱(Shell-Lab公司)，流式细胞仪(BD FACSCALIBUR)。

1.2 方法

1.2.1 细胞传代 原代β-TC-6细胞状态良好，细胞密度80%～90%。准备完全培养基(DMEM高糖+15%FBS热灭活)、PBS和胰酶。胰酶消化细胞，制备单细胞悬液。800 r/min离心3min，去除培养液，加入新鲜培养基重悬细胞。将细胞悬液按1∶2比例分到直径10 cm培养皿中，补加培养基至10 mL。把培养皿放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，间隔12～24 h，观察细胞生长状态。

1.2.2 细胞培养 培养胰岛细胞至对数生长期，接种于96孔板，每孔细胞数3×104。将细胞随机分为A～F组，A、B组分别置于不含FFA及含500 μmol/ L棕榈酸的培养基中培养，C～F组分别置于含0.1、1、10、50 μmol/L的Res+棕榈酸500 μmol/L的培养基中培养。每组设6个复孔，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中，观察细胞生长形态。

1.2.3 细胞凋亡检测 采用流式细胞术。各组细胞培养24 h后，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞，PBS洗涤细胞2次;1 000 r/min离心5min，离心2次后弃上清。每样本加200 μL Binding Buffer重悬细胞后加入10 μL AnnexinV-FITC，轻轻混匀，置室温避光孵育15 min;加入5 μL碘化丙啶，置相同条件下孵育5 min，1 h内入流式细胞仪检测凋亡细胞和正常细胞比率。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料以s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组胰岛β细胞存活率、凋亡率比较，见表1。

表1 各组胰岛β细胞存活率、凋亡率比较(%，s)

表1 各组胰岛β细胞存活率、凋亡率比较(%，s)

注:与A组比较，*P＜0.05;与B组比较，#P＜0.01;与C组比较，△P＜0.01;与D组比较，○P＜0.01。

组别 n 细胞存活率 细胞凋亡率A组6 90.31±4.70 7.40±2.99 B组 6 5.07±2.27* 95.82±1.94* C组 6 8.37±2.06*# 83.36±2.06*# D组 6 21.99±2.47*#△ 68.94±2.19*#△E组 6 88.67±1.17*#△○ 11.03±1.08*#△○F组 6 5.20±1.72* 95.65±1.72*

3 讨论

T2DM常合并血脂紊乱，脂代谢紊乱贯穿于T2DM发生、发展的始末，其与T2DM的关系得到广泛的关注。国内外众多实验都报道了脂毒性可引起β细胞功能紊乱及凋亡。所谓脂毒性是指血FFA水平升高后，超过脂肪组织的储存能力和各组织对FFA的氧化能力，使过多的FFA以甘油三酯的形式在非脂肪组织过度沉积而造成该组织的损伤。FFA可通过多种途径引起β细胞凋亡，如激活氧化应激［2］、诱导凋亡相关因子(神经酰胺［3］、Caspase家族［4］、凋亡相关蛋白激酶2［5］)失衡、内质网应激［6］、以及microRNA等［7］。

Res是一种天然的多酚类化合物，存在于多种中草药和其他植物中，如虎杖、葡萄、花生、桑葚、决明子、藜芦等。诸多研究表明，Res具有多重生物活性作用，包括抗肿瘤、抗氧化、抗炎、心血管保护等。尤其近年来研究发现，Res还具有降低血糖，改善胰岛素抵抗的作用，其具体机制目前还不是很明确。

本研究以FFA棕榈酸和不同浓度Res同时作用于胰岛β细胞，观察β细胞凋亡及存活比例，以期探索Res对棕榈酸诱导的β细胞凋亡的影响。结果显示，Res在一定浓度范围内(0.1～10 μmol/L)可明显抑制棕榈酸诱导的β细胞凋亡，且随着浓度的增加，这种抑制作用也逐步增强。而当浓度超过50 μmol/L时，Res抗凋亡作用消失。说明Res对胰岛β细胞凋亡的抑制是在一定浓度范围内的，而高浓度的Res并不能抑制β细胞凋亡。Res的这种抗凋亡作用可能与其抗氧化应激作用相关。研究表明，Res可显著升高细胞线粒体锰超氧化物歧化酶的蛋白水平和活性，发挥抗氧化应激作用［8］。另外，Res还可通过直接清除活性氧或者抑制NADPH氧化酶的活性，保护细胞免受损伤［9］。高FFA水平也是糖尿病氧化应激的直接来源之一。研究发现，FFA诱导的氧化应激可能与FOX01降低密切相关。而Res可能通过激活SIRTI使FOX01活性升高，从而缓解FFA诱导的氧化应激损伤［10］。近年来的研究表明，Res还可通过抑制IKK-β/IκB/NF-κB炎症信号通路［11］，激活 AMPK通路［12］、PI3K/Akt通路［13］等来发挥其降低血糖、改善胰岛素抵抗的作用。但是，由于Res的作用机制复杂，不同浓度的Res可产生截然不同的作用，相同浓度的Res处理不同的细胞亦可产生不同的作用。研究发现，当Res剂量为0.01～1.00 μmol/L时，可改善细胞的胰岛素敏感性，保护细胞功能［14］;而当其剂量超过10 μmol/L且培养时间超过24 h可对细胞产生毒性作用。另有研究发现，100 μmol/L Res培养24 h可诱导细胞凋亡［15］。本研究的结果与之相似，其具体机制还有待进一步研究。

总之，本研究证实在一定浓度范围内，Res能显著拮抗棕榈酸诱导的胰岛β细胞凋亡，从而为Res进一步应用于糖尿病临床治疗提供了理论基础。

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