刘果，孙洋，纪雪，佟盼盼，祝令伟，刘军，周伟，郭学军，冯书章

(军事医学科学院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，长春130122)



超级细菌NDM-1质粒的水平转移研究

刘果，孙洋*，纪雪，佟盼盼，祝令伟，刘军，周伟，郭学军，冯书章*

(军事医学科学院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，长春130122)

为探究超级细菌NDM-1质粒水平传播的特性，以携带NDM-1质粒的猫源洛菲不动杆菌和人源醋酸钙不动杆菌为供体菌，以工程菌株大肠杆菌DH5α和大肠杆菌、沙门氏菌弱毒菌株为受体菌，通过接合试验验证了NDM-1基因通过质粒跨种传播的可能性。结果显示，猫源NDM-1质粒可以转入E.coliDH5α中，并可以DH5α为中介，转入猪霍乱沙门氏菌C500中；而人源NDM-1质粒仅转入E.coliDH5α中，未能转入其他菌株。NDM-1质粒在沙门氏菌C500中比在E.coliDH5α中较为稳定遗传。质粒的导入并不影响宿主菌的生长特性。本研究初步揭示了NDM-1的传播方式，表明NDM-1质粒能够跨越菌种界限，并可以大肠杆菌为中介，转移至其它菌株中。

新德里β内酰胺酶-1；接合转移；水平传播

新德里β内酰胺酶-1(New Delhi Metallo-betalactamase-1,NDM-1)自2008年首次被发现以来，就在肠杆菌科细菌中迅速蔓延，成为一个全球性的公共卫生学问题[1]。鉴于宠物多与人密切接触以及NDM-1跨种传播的可能性，宠物体内出现NDM-1，更是引起了人们的担忧[2]。为了探究NDM-1质粒的水平转移特性，本研究以携带NDM-1质粒的猫源洛菲不动杆菌Iz4b和人源醋酸钙不动杆菌XM1570为供体菌，通过接合试验验证NDM-1质粒跨种传播的可能性，并对接合子特性进行研究，以期为预防和控制NDM-1的传播提供科学数据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供体菌：猫源洛菲不动杆菌Iz4b，人源醋酸钙不动杆菌XM1570。受体菌：大肠杆菌DH5α，致病性大肠杆菌EPEC E2348/69，出血性大肠杆菌O157 F25，鼠伤寒沙门氏菌SMT，猪霍乱沙门氏菌C500。以上菌株均由本实验室保存。

1.1.2 质粒 pBR322：携带氨苄西林(AMP)、四环素(TET)抗性；pBR325：携带氨苄西林、四环素和氯霉素(CHL)抗性；由本实验室保存。

1.1.3 主要试剂 亚胺培南(IPM)为Merck公司产品；氯霉素和四环素为Sigma公司产品；胰蛋白胨，酵母提取物为英国Oxoid公司产品。

1.1.4 主要仪器 生物安全柜(1300A2)购自美国Thermo公司；BD PhoenixTM-100 System细菌鉴定仪、Phoenix SpecTM比浊仪均购自美国BD公司；紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定 根据文献[3]合成引物，PCR鉴定上述两株供体菌的NDM-1基因。通过BD PhoenixTM-100 System全自动微生物鉴定/药敏系统对供体菌和受体菌进行生化及药敏检测。

1.2.2 受体菌筛选标记 通过电转化，向E.coliDH5α导入质粒pBR322，向其它受体菌株导入质粒pBR325，使其具有TET及CHL的抗性便于后续接合子的筛选。转化子分别标记为DH5α::pBR322、 E2348/69::pBR325、F25::pBR325、SMT::pBR325和 C500::pBR325。按照CLSI(2012版)推荐的微量肉汤稀释法，测定各转化子对TET及CHL的MIC。

1.2.3 接合试验 采用滤膜接合法，并根据文献[4-5],优化实验条件，如延长接合时间，提高供体菌和受体菌浓度，用亚抑菌浓度抗生素促进，用纳米材料促进等，多次进行接合试验。

滤膜接合法：将供、受体菌分别于相应抗性LB培养基中(供体菌为8 μg/mL IPM；受体菌：DH5α::pBR322为128 μg/mL TET，E2348/69::pBR325、F25::pBR325、SMT::pBR325、和C500::pBR325为100 μg/mL CHL)过夜培养，分别取1 mL供体菌和1 mL受体菌于1.5 mL离心管中，8000 r/min离心2 min，弃上清，用1 mL生理盐水清洗三次。向供体菌和受体菌分别加100 μL生理盐水重悬，然后将供体菌和受体菌混合，震荡混匀。取煮沸灭菌后的滤膜放在LB琼脂培养基上，滴加100 μL混合菌液于滤膜上。37 ℃恒温培养4 h后，用1 mL生理盐水冲洗滤膜，收集冲洗后的菌液，生理盐水100倍稀释后，取100 μL涂于相应的双抗LB平板(DH5α::pBR322作为受体菌时，双抗浓度为8 μg/mL IPM，128 μg/mL TET；其他菌株为受体菌时，双抗浓度为8 μg/mL IPM，100 μg/mL CHL)。37 ℃恒温培养16～20 h，双抗平板上生长的单菌落判定为疑似接合子。

1.2.4 接合子鉴定 挑取双抗平板上生长的单菌落培养，根据文献[6-7]合成大肠杆菌和沙门氏菌特异性引物，PCR验证疑似接合子。对PCR呈NDM-1阳性的菌株，使用大肠杆菌或沙门氏菌的特异性引物PCR验证菌株是否为接合子。对于验证阳性的接合子，通过BD PhoenixTM-100 System全自动微生物鉴定/药敏系统进行生化和药敏鉴定。

1.2.5 最小抑菌浓度(MIC)试验 按照CLSI推荐的微量肉汤稀释法，测定供受体菌及接合子对IPM的MIC。

1.2.6 NDM-1质粒遗传稳定性实验 将供体菌及接合子划线于IPM(16 μg/mL)抗性平板上，挑取单菌落于抗性液体LB培养基中，37 ℃培养12 h，取5 μL菌液于5 mL新鲜无抗LB液体培养基中，过夜培养后，稀释涂布于无抗LB琼脂平板上，长出单菌落后，挑取230个左右单菌落，点种于IPM(16 μg/mL)抗性LB平板，在抗性平板上不生长的菌落即为质粒丢失的菌株。质粒的丢失率=不生长的菌落数/挑取的菌落总数。

1.2.7 接合子生长特性 从抗性平板上挑取受体菌DH5α::pBR322、C500、C500::pBR325以及所获得的接合子的单菌落，于5 mL抗性液体培养基中，37 ℃恒温摇床中培养过夜。取1 mL菌液于100 mL 新鲜LB培养基中，充分振荡，混合均匀， 37 ℃恒温180 r/min振荡培养，用紫外可见分光光度计于波长600 nm处测定菌液吸光度，每小时测定一次。观察NDM-1质粒对于宿主菌生长特性的影响。

2 结果与分析

2.1 供受体菌鉴定 经PCR鉴定，供体菌Iz4b和XM1570均携带NDM-1耐药基因。细菌鉴定及药敏检测结果表明，Iz4b对所测的β-内酰胺类、磺胺类、喹诺酮类抗生素均耐药，对IPM的MIC为512 μg/mL，对阿米卡星敏感；XM1570对所测的β-内酰胺类抗生素耐药，对IPM的MIC为256 μg/mL，对其他抗生素均敏感。受体菌对所测抗生素均敏感。供体菌及部分受体菌药敏检测结果见表1。

表1 供体菌和部分受体菌药敏检测结果表

注：R：耐药；I：中介；S：敏感。MIC：细菌鉴定仪药敏检测结果。*MIC：参照CLSI，用微量肉汤稀释法测定的MIC值

2.2 质粒电转化 pBR322转入DH5α后，DH5α::pBR322对TET的MIC提高至256 μg/mL；pBR325转入大肠杆菌弱毒株E2348/69、F25，以及沙门氏菌疫苗株SMT、C500后，转化子对CHL的MIC提高至512 μg/mL。

2.3 接合试验 在滤膜接合法实验中，将NDM-1质粒从洛菲不动杆菌Iz4b中转移至DH5α::pBR322中，命名为DH5α::pBR322-NDM-1。DH5α::pBR322-NDM-1容易丢失质粒而变得对IPM敏感，在抗性条件下连续传代，获得了一个稳定菌株，命名为DH5α::pBR322-NDM-1-1。将NDM-1质粒从醋酸钙不动杆菌XM1570中转入DH5α::pBR322中，命名为DH5α::pBR322-NDM-1-2。而其余四个弱毒受体菌均未能直接通过接合试验获得两供体菌的NDM-1质粒。以DH5α::pBR322-NDM-1-1及DH5α::pBR322-NDM-1-2为供体菌，继续向其他受体菌中接合转移，NDM-1质粒从DH5α::pBR322-NDM-1-1转移至猪霍乱沙门氏菌C500::pBR325中，接合子命名为C500::pBR325-NDM-1。

2.4 接合子鉴定 接合子DH5α::pBR322-NDM-1、DH5α::pBR322-NDM-1-1、DH5α::pBR322-NDM-1-2和C500::pBR325-NDM-1通过NDM-1基因引物和特异性引物PCR验证均为阳性。药敏检测结果表明，除DH5α::pBR322-NDM-1外，其他接合子均获得了β-内酰胺类耐药表型，对IPM的MIC提高至128 μg/mL以上，具体结果见表2，结果表明NDM-1质粒可以从不动杆菌跨种传播到大肠杆菌和沙门氏菌中。

表2 接合子药敏检测结果表

注：R：耐药；I：中介；S：敏感。MIC：细菌鉴定仪药敏检测结果。*MIC：参照CLSI，用微量肉汤稀释法测定的MIC值。

2.5 NDM-1质粒的遗传稳定性 在无抗性LB液体中培养12 h，供体菌及接合子的质粒丢失率如表3。结果表明，NDM-1质粒在原宿主菌中能稳定存在。Iz4b中NDM-1质粒在新的宿主菌DH5α::pBR322中极不稳定，接合子在无抗LB液体中培养12 h后，质粒几乎完全丢失。而抗性条件下传代获得的菌株，质粒会相对稳定的存在，但丢失率超过50%，转入C500后，质粒稳定性增加。XM1570中NDM-1质粒在DH5α中易丢失，12 h培养，丢失率达80.6%。

表3 NDM-1质粒丢失率表

2.6 接合子的生长特性 DH5α::pBR322、DH5α::pBR322-NDM-1-1和DH5α::pBR322-NDM-1-2及C500、C500::pBR325和C500::pBR325-NDM-1的生长曲线如图1所示。由图中可知，原受体菌与接合子生长曲线无显著差异，因此NDM-1质粒并不影响宿主菌的生长特性。

3 讨论与小结

图1 受体菌及接合子生长曲线(A. DH5α::pBR322及接合子生长曲线；B. C500，C500::pBR325及接合子生长曲线)

超级细菌携带NDM-1质粒，可耐受几乎所有的抗生素，因而具有重要的公共卫生意义。目前，NDM-1在世界各地肠杆菌科的大部分细菌中，包括肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、弗氏柠檬酸杆菌等均被发现，我国被认为是继印度和巴基斯坦之后的NDM-1多发国之一[8]。在我国检测到的多种携带NDM-1的肠杆菌菌株大多为散发，这标志着NDM-1的传播主要由接合性质粒及其携带的可移动元件介导，这与其它国家监测到的NDM-1的传播特点相一致[9]。目前对NDM-1传播方式的探究多为基于流行病学调查结果所做的推断，迫切需要研究来验证和揭示NDM-1传播的特点及其潜在传播机制。

细菌耐药性传播的重要方式之一是接合(conjugation)，耐药性质粒作为可移动遗传元件通过细菌表面的性纤毛从一个细菌转移到另一个细菌，并使受体菌获得相应的耐药表型。大量文献[9-11]表明，NDM-1质粒可以通过接合的方式转移至工程菌株E.coliJ53及DH5α中，但国内外尚未见到向其他弱毒及野生菌株转移的报道。Iz4b是本实验室于2012年从病犬体内分离得到的一株亚胺培南耐药的洛菲不动杆菌(Acinetobacterlwoffii)，其携带的NDM-1位于质粒上，我们将该质粒命名为pNDM-Iz4b。全质粒测序结果表明：该质粒全长46570 bp，其大部分序列与人源醋酸钙不动杆菌XM1570[10]中NDM-1质粒pXM1一致，仅在接合转移相关的区域(traC)有705 bp的缺失，此705 bp包含一个调节核酸酶活性相关蛋白的编码基因和206 bp的正向重复序列。两质粒均含有traA、traC和traD三个与接合转移有关的基因，且在NDM-1上下游有ISAba125，构成了Tn125转座子。说明NDM-1耐药基因可能通过转座以及细菌之间的接合等方式传播，而跨种传播到其他细菌中。

Iz4b和XM1570作为供体菌时，只有工程菌株DH5α获得了NDM-1质粒，说明工程菌株相对于其它菌株更容易接受外源大质粒。猫源Iz4b的NDM-1质粒在DH5α宿主中不能稳定遗传，这与Chen[11]等的报道一致。抗性条件下传代后能获得相对稳定的菌株，说明抗性条件有利于细菌耐药基因的稳定存在。以稳定的DH5α接合子为中介，pNDM-Iz4b可接合转移至猪霍乱沙门氏菌C500中，而pXM1未能转移，可能与两质粒序列差异有关。黄瑞等[12]曾用接合试验验证了伤寒杆菌耐药质粒pRST98能在4种肠道杆菌间传递，同时能以大肠杆菌为媒介，将耐药基因转移给其他肠道菌。因此肠道中数量庞大的大肠杆菌可以作为耐药基因的储存库和中转站，将耐药基因从非致病菌转移至致病菌，这将会给人类健康构成严重的威胁。

本研究揭示了NDM-1质粒可以通过接合方式传播其耐药性，在研究NDM-1质粒这种转移方式时，发现了有趣而重要的现象，这就是：①NDM-1质粒可以跨种传播，从不动杆菌转移到大肠杆菌和沙门氏菌；②NDM-1质粒的遗传稳定性依受体菌种类不同而有所差异，在所实验的大肠杆菌和沙门氏菌中，NDM-1质粒在沙门氏菌中能够较为稳定的遗传；③NDM-1质粒的跨种传播受受体菌遗传背景的影响，受体菌所携带的自然质粒(尤其是不相容性质粒)可能在一定程度上影响着NDM-1质粒接合性转移或转化效率和传播速度。此研究结果对于深入探究超级细菌的形成及其耐药性的传播具有重要意义。

近年来，NDM-1在中国的流行有加重的趋势，流行病学调查结果显示，克隆株传播造成的暴发[13-14]和由接合性质粒及其携带的可移动遗传元件(如ISAba125,Tn125等)介导的跨种传播[9,11,15]，是导致NDM-1流行的主要原因。鉴于NDM-1能够突破菌属和地理界限而传播，世界各国均应加强NDM-1的监测，深入探讨其跨种传播的可能方式，研究针对这类超级细菌的控制技术。

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(编辑：侯向辉)

Horizontal Transferability of NDM-1 Plasmid

LIU Guo,SUN Yang*, JI Xue,TONG Pan-pan, ZHU Ling-wei, LIU Jun, ZHOU Wei, GUO Xue-jun,FENG Shu-zhang*

(InstituteofMilitaryVeterinary,AMMS/KeyLaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl,Changchun130122,China)

The purpose of this study was to explore the horizontal transmission properties of NDM-1 plasmids in superbugs.Acinetobacterlwoffiiof cat origin andAcinetobactercalcoaceticusof human origin were used as donor strains,Escherichiacolistrain DH5α and four attenuated strains(twoE.colistrains and twoSalmonellastrains)were used as recipient strains, and conjugation experiment was conducted to explore the cross-species transferability of NDM-1 mediated by plasmids. The results showed NDM-1 plasmid of cat origin was able to transfer into DH5α, and then toSalmonellacholeraesuis C500 strain mediated by DH5α. NDM-1 plasmid of human origin was able to transfer to DH5α, but failed to transfer to other strains. Furthermore, NDM-1 plasmids in C500 could be more stably inherited than inE.coliDH5α. The plasmid transferred didn’t influence the growth properties of the host strains. This study indicated that NDM-1 plasmids were able to cross the genetic boundaries and transfer to other strains mediated byE.coli,which may shed some light on the horizontal transmission of NDM-1.

NDM-1;conjugation;horizontal transfer

科技部传染病防治重大专项(2013ZX10004217)；863项目(2012AA022006)；吉林省科技计划项目(20140101032JC，20150101110JC)

刘果，硕士研究生，从事细菌耐药性研究。

冯书章,E-mail: shuzhangfeng@qq.com；孙洋,E-mail：sunyang10@hotmail.com

2015-07-17

A

1002-1280 (2015) 10-0015-07

S852.61