于桂梅，周微微，祖述龙，王子龙,2，陈 曦，葛金英*，步志高*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150001；2.河北农业大学 动物医学学院，河北 保定 071000)

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)引起的人和动物神经系统病变，死亡率高达100 %，为重要的人兽共患病之一[1]。RV 为弹状病毒科狂犬病毒属，具有囊膜的单股负链RNA 病毒。该病毒主要编码5 种蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、病毒RNA 聚合酶(L)和一个糖蛋白(G)[2-4]。其中G 蛋白以三聚体的形式锚定于病毒囊膜表面，并能够与细胞表面的受体结合，介导膜融合使病毒侵入细胞[5]。同时，G 蛋白是RV 主要的抗原蛋白，刺激机体产生中和抗体[6]。

本研究以新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F 蛋白)的跨膜区(TM)和膜内区(CT)替换RV G 的相应部分，研究其对G 蛋白在表达G 蛋白的重组NDV(rL-RVGTC)中的表达及相关生物学特性的影响，结果显示TM 和CT 对RV G 的形成病毒蚀斑及免疫原性是必不可少的。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 表达RV G 蛋白的重组NDV(rL-RVG)、重组NDV 弱毒疫苗株rLaSota(rL)、NDV感染克隆pBRN-FL-PmeⅠ、辅助核蛋白(pBS-NP)、磷蛋白(pBS-P)、和大聚合酶蛋白(pBS-L)重组质粒、表达GFP 蛋白的NDV 重组病毒和RV 重组病毒均由本实验室构建；表达T7 聚合酶的重组痘病毒vTF7-3 由Moss 博士惠赠；鸡抗NDV、犬抗RV 高免血清均由本实验室制备[7]；FITC 标记兔抗犬IgG(IgG-FITC)、羊抗鸡IgG-TRITC、兔抗鸡IgG-HRP 及羊抗兔IgG-HRP 二抗均购自Sigma 公司。SPF 鸡胚和SPF 雏鸡由本研究所SPF 实验动物中心提供；SPF 级BALB/c 鼠购自北京维通利华公司。

1.2 表达RVGTC基因的重组感染性克隆的构建为将RV G 的TM 和CT 替换为NDV F 蛋白的TM和CT，人工合成嵌合RVGTC 基因，并在其两端分别引入转录调控启动子(GS)、终止子(GE)序列及PmeⅠ酶切位点。经PmeⅠ酶切处理后插入感染性克隆载体pBRN-FL-PmeⅠ中，构建表达RVGTC 基因的pBRN-FL-RVGTC 感染性克隆。

1.3 重组病毒的拯救及鉴定 参考文献[7]的方法拯救病毒。提取血凝阳性的鸡胚尿囊液总RNA。以RV G 蛋白基因特异性引物进行重组病毒RT-PCR 鉴定，并将拯救的重组病毒命名为rL-RVGTC。

1.4 RVGTC蛋白表达的检测 分别将MOI 为0.1的rL、rL-RVG 和rL-RVGTC 感染BHK-21 细胞，24 h后以预冷的3%的多聚甲醛室温固定20 min。分别以犬抗RV(1∶50)和鸡抗NDV(1∶100)为一抗，兔抗犬IgG-FITC(1∶100)和羊抗鸡IgG-TIRTC(1:100)为二抗，采用0.5 μg/mL 的DAPI 进行细胞核染色。利用激光共聚焦显微镜进行间接免疫荧光检测(IFA)。

将rL、rL-RVG 和rL-RVGTC 接 种BHK-21 细胞，培养72 h 后刮取细胞裂解处理后，分别以鼠抗β-actin(1∶5 000)、兔抗RV(1∶50)和鸡抗NDV(1∶100)为一抗，兔抗鸡IgG-HRP(1:2 000)或羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)为二抗，经western blot 进行检测。

1.5 rL-RVGTC扩散方式的观察及其滴度的鉴定以rL、rL-RVG 及rL-RVGTC 分别感染BHK-21 细胞，在感染不同时间点分别固定相应细胞进行IFA检测，观察重组病毒是否形成蚀斑。同时收集相应时间点的细胞培养上清液，利用9 日龄～11 日龄SPF 鸡胚测定其中重组病毒含量(EID50)，对比3 种病毒在细胞培养过程中产生子代病毒能力的变化。

1.6 重组病毒的致病性试验及病毒的生长曲线对重组病毒rL-RVGTC F3 代进行鸡胚平均致死时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)及静脉致病指数(IVPI)等致病性指标测定，检测RVGTC 蛋白的表达对NDV 致病性的影响。

以剂量为104.375EID50的rL、rL-RVG 和rL-RVGTC分别接种10 日龄的SPF 鸡胚，每12 h 分别收取5个鸡胚的尿囊液测定其TCID50，直至108 h，并根据测定结果绘制生长动力学曲线。

1.7 重组病毒的免疫试验 24 只6 周龄的BALB/c小鼠随机平均分成两组，分别经肌肉注射途径接种5×107EID50的rL-RVG 和rL-RVGTC，于免疫后第3周和第4 周后采血，测定血清中NDV 和RV 的特异性中和抗体，第4 周进行二次加强免疫，二免后间隔两周(待抗体水平变化平稳后延长采血间隔时间到4 周)采血测定两组小鼠抗体水平变化，比较TM 和CT 的替换对G 蛋白免疫原性的影响。

2 结果

2.1 表达RVGTC基因的重组病毒感染性克隆的构建和重组病毒的拯救 利用人工合成的编码G 蛋白的TM 和CT 序列替换为NDV F 蛋白相应部分RVGTC 蛋白基因插入NDV 感染性克隆pBRNFL-PmeI 中，构建表达嵌合RVG 蛋白RVGTC 的重组NDV cDNA 克隆pBRN-FL-RVGTC。

将pBRN-FL-RVGTC 与表达NDV NP、P、L 蛋白的辅助质粒共转染BHK-21 细胞。收获细胞及上清液接种9 日龄～11 日龄SPF 鸡胚，培养5 d 后收取HA 检测阳性的尿囊液(含有拯救重组病毒)命名为rL-RVGTC。

2.2 重组病毒的RT-PCR鉴定 提取血凝阳性的尿囊液总RNA，利用RT-PCR 方法扩增出约800 bp的片段(图1)。序列分析结果显示，重组病毒基因组的预期位点正确插入了RVGTC 基因及所引入的转录调控序列。

图1 RT-PCR 鉴定重组病毒的RVGTC 基因Fig.1 Identification of recombinant virus of rL-RVGTC by RT-PCR

2.3 RVGTC 蛋白表达的检测 将rL-RVGTC、rL-RVG 和亲本株rL 分别感染BHK-21 细胞，培养24 h 后固定细胞。以鸡抗NDV 和犬抗RV 高免血清为一抗，羊抗鸡IgG-TIRTC 和兔抗犬IgG-FITC 为二抗，DAPI 进行细胞核染色制备共聚焦样品。结果显示以抗NDV 高免血清为一抗，3 株病毒感染的细胞均为阳性，而以犬抗RV 高免血清为一抗，只有rL-RVG 和rL-RVGTC 感染的细胞为阳性。这表明rL 感染的细胞内只有NDV 蛋白表达，而在rL-RVG和rL-RVGTC 感染的细胞内既有NDV 蛋白又有RV G 蛋白的表达(图2)。

分别将rL、rL-RVG 和rL-RVGTC 感染BHK-21细胞72 h 后，刮取细胞裂解处理后以鼠抗β-actin，鸡抗NDV 和兔抗RV 高免血清为一抗，兔抗鸡和羊抗兔IgG-HRP 为二抗，经western blot 分析。并通过测定蛋白浓度确定rL、rL-RVG 和rL-RVGTC 相同的上样量，结果显示rL 感染细胞蛋白样品只检查到一条NDV 特异性条带，而rL-RVG 和rL-RVGTC 感染细胞的蛋白样品能够同时检测到NDV 和RVGTC两条特异性条带，并且rL-RVG 和rL-RVGTC G 蛋白在细胞中的表达量无明显的区别(图3)。

图2 激光共聚焦观察RVGTC 蛋白在重组病毒感染细胞内的表达Fig.2 Immunofluorescence analysis of RVGTC protein expression and subcellular localization examed by LSM

图3 RVGTC 在BHK-21 细胞中表达的western blot 检测Fig.3 Analysis of RVGTC protein expression by western blot

2.4 rL-RVGTC蚀斑形成能力检测 rL、rL-RVG和rL-RVGTC 分别感染BHK-21 细胞，在感染后特定的时间点固定细胞进行IFA 观察其在细胞上的扩散形式。结果表明，rL-RVG 能够从最初感染的细胞扩散到临近细胞，形成病毒蚀斑，而rL-RVGTC与rL 的扩散方式相同，从感染后24 h 到84 h，细胞的感染密度未发生明显改变(图4)。

rL、rL-RVG 和rL-RVGTC 分别感染BHK-21 细胞，在特定的时间点收集感染细胞上清液经鸡胚测定其EID50，测定对比3 种病毒后代的毒力。结果显示，不同时间点上清液rL、rL-RVG 和rL-RVGTC的EID50无明显差异。rL-RVGTC 的滴度在感染后72 h 达到峰值，其病毒滴度与rL 相似，但1/5 log低于rL-RVG(图5)。将一部分上清液在细胞中进行病毒滴定，发现其不能感染细胞。表明RVGTC 没有改变rL-RVGTC 子代病毒的扩散能力。

图4 rL-RVGTC 病毒蚀斑形成的观察Fig.4 Observation of the ability of rL-RVGTC to form virus plaque

图5 重组病毒在感染BHK-21 细胞上清液的病毒滴度Fig.5 Titer of recombinant viruses in the supernatant of infected BHK-21 cells

2.5 重组病毒的致病性分析 重组病毒株rLRVGTC F3 代 的EID50为108.375/0.1 mL；MDT 大 于120 h，ICPI 和IVPI 均为0，该结果表明重组弱毒苗保持了rL 亲本疫苗株对鸡胚的高滴度生长适应和低致病的特性。

以104.375EID50的rL、rL-RVG 和rL-RVGTC 分别接种10 日龄的SPF 鸡胚，每12 h 分别收取5 个鸡胚的尿囊液测定其TCID50。各个时间点rL、rL-RVG和rL-RVGTC 生长滴度没有明显的差异，rL-RVGTC与rL 和rL-RVG 具有相似的生长动力学曲线和相似的病毒滴度。

2.6 rL-RVG与rL-RVGTC在诱导抗体水平的比较通过免疫小鼠血清检测，其中和抗体水平在一免和二免后，rL-RVG 和rL-RVGTC 诱导的相同水平的NDV 中和抗体。然而，rL-RVG 诱导的RV 抗体水平显著高于rL-RVGTC。一免后，免疫rL-RVG 的一组小鼠83.3 %以上中和抗体达到到有效提供免疫保护水平，而免疫rL-RVGTC 的一组小鼠只有33.3 %的小鼠的中和抗体达到免疫保护水平(图6)。

图6 rL-RVG 和rL-RVGTC 在小鼠体内诱导产生的病毒中和抗体水平Fig.6 VNA levels induced by recombinant viruses

3 讨论

本实验室前期构建了表达RV G 的重组新城疫病毒rL-RVG，结果表明在G 蛋白的作用下，rL-RVG 能够从感染细胞扩散到周围细胞，形成明显的病毒蚀斑[8]。同时，rL-RVG 能在小鼠体内引发针对RV 的剂量依赖性的有效的持久的保护[8]。此外，PV 株和CVS 株的RV G 蛋白替换其TM 和CT后只能以单聚体的形式存在，免疫原性下降[9]。

为研究TM 和CT 对ERA 株RV G 蛋白表达，病毒蚀斑形成和免疫原性的影响。在本研究中，我们将RV G 蛋白的TM 和CT 用NDV F 蛋白的相应部分进行替换，将嵌合RV G 蛋白插入到NDV 载体拯救病毒后进行检测。IFA 和western blot 结果显示RV G 和RVGTC 在BHK-21 细胞水平上表达量没有显著差异，表明TM 和CT 的替换对RVG 自身的表达影响不大。但TM 和CT 的替换改变了G 蛋白的融合能力，使rL-RVGTC 病毒失去了在BHK-21 细胞上形成病毒蚀斑的能力。这与文献中报道的RV G 替换TM 和CT 后以单体的形式存在，不能发生相应构象的变化的结果是一致的[9]。这进一步证明了RVG TM 和CT 对其三聚体的形成以及其扩散作用是必需的。

TM 和CT 的替换对rL-RVGTC 生长动力学几乎没有影响，无论是在鸡胚还是在细胞上的复制均无明显改变，但其免疫原性明显下降，这有可能是因为RVGTC TM 和CT 的替换影响了其膜外区的折叠[9]，从而使有效的抗原表位减少。证明TM 和CT 对RV G 有效的免疫原性有重要作用。

[1]Dietzschold B,Schnell M,Koprowski H.Pathogenesis of rabies[J].CTMI,2005,292:45-56.

[2]Faber M,Li Jong-ming,Kean R B,et al.Effective preexposure and postexposure prophylaxis of rabies with a highly attenuated recombinant rabies virus[J].PNAS USA,2009,106:11300-11305.

[3]Dietzschold B,Wunner W H,Wiktor T J,et al.Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus[J].PNAS USA,1983,80:70-74.

[4]Dietzschold B,Wang H H,Rupprecht C E,et al.Induction of protective immunity against rabies by immunization with rabies virus ribonucleoprotein[J].PNAS USA,1987,84:9165-9169.

[5]Jayakar H R,Jeetendra E,Whitt M A.Rhabdovirus assembly and budding[J].Virus Res,2004,106:117-132.

[6]Wiktor T J,Macfarlan R I,Reagan K J,et al.Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene[J].PNAS USA,1984,81:7194-7198.

[7]冯秋霖，刘茂军，祁芳，等.表达鸡支原体TM1 蛋白基因重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究[J].中国预防兽医学报，2013，35(10)：779-782.

[8]Ge Jin-ying,Wang Xi-jun,Tao Li-hong,et al.Newcastle disease virus-vectored rabies vaccine is safe,highly immunogenic,and provides long-lasting protection in dogs and cats[J].J Virol,2011,85:8241-8252.

[9]Gaudin Y,Moreira S,Benejean J,et al.Soluble ectodomain of rabies virus glycoprotein expressed in eukaryotic cells folds in a monomeric conformation that is antigenically distinct from the native state of the complete,membrane-anchored glycoprotein[J].J Gen Virol,1999,80(7):1647-1656.