何淑仪，马 骏，方 博，孙彦阔，罗永峰，秦 锋，郑 运，曹振鹏，周 沛，粟 硕，张桂红

(华南农业大学兽医学院/国家生猪种业工程技术研究中心，广东广州 510642)

猪A 型流感病毒(Swine influenza virus，SIV)可以造成猪急性和高度接触性呼吸道疾病，能够引起不同日龄及品种的猪感染发病[1]。

1993 年，Guan 等从中国南方以及东南亚地区分离出类禽(Eurasian Avian-like，EA)H1N1 SIV[2]。随后，EAH1N1 SIV 在亚洲地区猪群中广泛流行。大部分H3N2 SIV 是由人流感病毒通过跨种间传播到猪群形成的[3]。2009 年甲型H1N1/2009 流感(H1N1 pdm09)在墨西哥暴发，并且迅速蔓延感染全球其他国家地区的人和猪群。H1N1pdm09 流感病毒来源于猪，是一种人、猪、禽三源重组病毒[4]。猪呼吸道上皮具有2 种流感病毒受体，能够同时感染人流感病毒和禽流感病毒。因此猪被认为是流感病毒的“混合器”，对新型流感病毒的形成起到重要的作用[5-6]。了解猪群中流感的疫情动态是人类流感防控的重要依据，具有重大的公共卫生学意义。

国际组织如WHO、OIE 和FAO 认为在全世界范围内急需开展流感监测活动[7]。中国华南地区被认为是世界流感病毒流行的中心之一[8]。为调查华南地区猪场SIV 和H1N1pdm09 流感病毒的感染情况，本研究室对2013 年～2014 年采集的2 208 份血清样品进行了H1N1 SIV、H3N2 SIV 和H1N1pdm09流感病毒的血清学检测。

1 材料和方法

1.1 参考病毒株 A/swine/Guangdong/SS1/2012(HINI)(HIN1 SIV)、A/swine/Guangdong/L22/2010(H3N2 SIV)和A/Guangdong/1057/2010(H1N1pdm09)均由华南农业大学兽医学院禽病实验室提供。

1.2 血清样品 2013 年10 月～2014 年9 月，在广东省、广西省、江西省、湖南省、福建省共73 个猪场，采集未进行流感疫苗免疫的临床健康猪的血清样品2 208 份。并详细记录猪只的年龄、样品的采集时间和来源地址。

1.3 血清样品的检测 通过血凝抑制试验(HI)，对采集的2 208 份血清样品进行血清学检测。为防止血清学检测中非特异性结果，采用受体破坏酶(RDE)处理血清样品，去除血清中非特异性抑制因子。RDE 购自美国Sigma 公司。根据各株抗原病毒的血凝(HA)效价配制4 个HAU(4 单位抗原)。依据OIE 标准血清学诊断手册说明进行HI 试验，记录HI 效价。检验结果为阳性或阴性的临界值(Cut off point)为1∶40，HI 价≥1∶40 时，结果判定为阳性。

1.4 数据分析 使用SPSS 和GraphPad Prism 软件进行统计学分析。基于二项分布95 %置信区间(Confidence interval，CI)计算SIV 和H1N1pdm09 流感病毒血清抗体阳性率，并用卡方检验χ2比较各组数据的差异是否具有统计学意义。计算流感病毒抗体几何平均滴度(Geometric mean antibody titers，GMT)。

2 结果

2.1 华南地区猪场SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗体检测结果 采用HI 试验对华南地区2 208 份血清样品进行SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗体检测分析，阳性血清共1 269 份(57.47 %)，结果显示，H1N1 SIV、H3N2 SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗体阳性血清分别为497 份(22.51 %)、728 份(32.97 %)和585 份(26.49 %)。其中，H3N2 SIV 抗体阳性率最高(p<0.01)。并且在571 份血清中同时检测到至少两种亚型流感病毒抗体，其中有290 份血清存在H1N1 SIV 与H1N1pdm09 流感病毒混合感染，高于其他亚型之间的混合感染(p<0.05)。另外，只在65份血清中同时检测到3 种亚型流感病毒抗体(表1)。

2.2 华南地区猪场SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗体滴度分布情况和以及其GMT 2 208 份血清样品进行SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗体检测后，通过GraphPad Prism 软件分析抗体滴度分布情况和计算GMT，结果显示，H1N1 SIV、H3N2 SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗体GMT 分别为88.14±1.04、67.27±1.03 和91.93±1.04(图1)。其中H1N1pdm09流感病毒的GMT 最高(p<0.05)，抗体滴度最高可达1:1 280，而H3N2 SIV 的GMT 最低(p<0.05)，抗体滴度最高只达1:640。

表1 华南地区猪群(n=2 208)SIV 和H1N1pdm09流感病毒HI 抗体的检测情况Table 1 Statistics of pigs(n=2,208)with HI antibodies to SIV and H1N1pdm09 virus in Southern China

图1 H1N1 SIV、H3N2 SIV 和H1N1pdm09 流感病毒的抗体滴度分布情况以及其GMTFig.1 The antibody titers distribution and GMT of H1N1 SIV,H3N2 SIV and H1N1pdm09 virus

2.3 华南地区SIV 和H1N1pdm09 流感病毒的季节性流行特征 采用HI 试验，对华南地区2 208 份血清样品进行SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗体检测，并且按照时间顺序对HI 检测结果进行分析。结果如图2 所示，H1N1 SIV 在12 月抗体阳性率为46.81%，达到全年最高(p<0.01)，但在1 月和2 月抗体阳性率持续下降，在2 月达到最低(5.74 %，p<0.01)。H3N2 SIV 在2 月也达到全年最低(p<0.01)。但在此时间段H1N1pdm09 流感病毒抗体阳性率只有轻微的变化，从29.08%降到24.40%。在5 月和9 月H1N1 pdm09 流感病毒抗体阳性率达到最高(36.90 %，p<0.01)。在5 月H1N1 SIV、H3N2 SIV 抗体阳性率也出现另一个高峰(p<0.01)。

2.4 华南地区各省份猪场SIV 和H1N1pdm09 流感病毒的感染情况 对华南地区广东省、广西省、福建省、湖南省和江西省5 个省份的猪场血清样品进行了SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗体检测分析，发现SIV 和H1N1pdm09 流感病毒的流行存在明显的区域性差异(p<0.01)，广东省(64.48 %)和广西省(75.00 %)的总阳性率明显高于福建省(49.77 %)、江西省(37.21 %)和湖南省(55.45 %)。湖南省的H1N1 SIV 抗体阳性率最高(35.45 %，p<0.01)。广西省的H3N2 SIV 抗体阳性率最高(53.45 %，p<0.01)。5 个省份猪场血清样品的H1N1pdm09 流感病毒抗体阳性率差异不明显(图3)。

图2 按照时间顺序分析华南地区H1N1 SIV、H3N2 SIV和H1N1pdm09 流感病毒抗体阳性率Fig.2 Seroprevalences against H1N1 SIV,H3N2 SIV and H1N1pdm09 virus were analyzed by time-series decomposition

图3 华南地区各省H1N1 SIV、H3N2 SIV 和H1N1pdm09流感病毒抗体阳性率(按以上顺序展示)Fig.3 Seroprevalences of H1N1 SIV,H3N2 SIV and H1N1pdm09 virus in different provinces in southern China

2.5 不同年龄猪群SIV 和H1N1pdm09 流感病毒的感染情况 采用HI 试验，对仔猪、育肥猪和母猪的H1N1 SIV、H3N2 SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗体进行检测和分析比较，结果如表2 所示(年龄记录不完整的血清样品，将不进行分析)，母猪体内的H1N1 SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗体阳性率均比仔猪和育肥猪高，但它们的H1N1pdm09 流感病毒抗体阳性率差异并不显著(p>0.05)。仔猪的H3N2 SIV抗体阳性率比母猪和育肥猪高，但差异也不显著(p>0.05)。

表2 仔猪、育肥猪和母猪H1N1 SIV、H3N2 SIV 和H1N1pdm09 流感病毒的血清学检测Table 2 Seroprevalences against HIN1 SIV,H3N2 SIV and H1N1pdm09 virus in piglets,finishing pigs and sows

3 讨论

根据HI 试验检测结果，华南地区猪场广泛存在SIV 和H1N1pdm09 流感病毒感染。虽然H3N2 SIV抗体阳性率最高(p<0.01)，但其抗体滴度普遍偏低(p<0.05)。H1N1pdm09 流感病毒的GMT 最高(p<0.05)。有报道在中国猪群分离到H1N1pdm09 流感病毒与H3N2 SIV 的重组病毒[9]，这表明H1N1pdm09 流感病毒逐渐在猪群中流行。本研究调查结果显示华南地区猪场存在两种或两种以上不同亚型流感病毒的混合感染。

本研究对SIV 和H1N1pdm09 流感病毒在猪群中流行的季节性特征进行了分析研究，表明华南地区猪场全年均存在H1N1 SIV、H3N2 SIV 和H1N1pdm09流感病毒感染，但它们的季节性特征不明显，而且不同亚型之间差异性显著(p<0.01)。对于H1N1 SIV和H3N2 SIV，在冬季抗体阳性率最高(p<0.01)，与他人的研究结果一致[10-11]。值得注意的是，在2 月(同样也是冬季)它们的抗体阳性率最低(p<0.01)。H1N1pdm09 流感病毒在猪群中流行的季节性特征与SIV 截然不同，也与人流感病毒的季节性特征不同[12]。近几年对流感病毒在猪群流行的季节性特征研究较少，所以出现以上现象的原因还不清楚。位于不同气候区域的猪场和现代养殖体系都有复杂的环境控制系统和不同的管理制度[11]，猪流感的季节性可能不明显，与人流感的季节性特征不同。所以对于SIV 和人流感病毒在猪群中流行的季节性特征有待继续深入研究，这对流感病毒防控措施的制定将起到相当重要的作用。

有研究发现仔猪的母源抗体能够持续2～4 个月[13]。由于母源抗体的存在，在仔猪体内流感病毒的感染和传播受到了限制。因此，一般情况母猪和育肥猪的血清阳性率比仔猪高。然而，我们却发现仔猪的H3N2 SIV 抗体阳性率较高。H3N2 SIV 与人流感病毒密切相关。许多研究表明，人可能是畜群感染流感病毒的原因之一[14]。因此，在SIV 的防控中，猪场应该限制人员进出，特别要严格控制人与仔猪的接触。加强对仔猪的饲养管理，保持饲养环境清洁。

本研究表明，SIV 和H1N1pdm09 流感病毒在华南地区广泛流行，存在区域性差异，广东省和广西省的感染情况较为严重，需要进一步的研究调查分析原因。SIV 和H1N1pdm09 流感病毒在猪群中流行的季节性特征和对不同年龄猪群抗体阳性率的检测分析结果，为制定和实施有效的流感防控措施提供参考。

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