冯爱东，刘　莲，杨　莉，金　鹏，王　慰，刘云燕(河北省石家庄市第五医院肝病科，河北 石家庄 050021)



·论著·

乙型肝炎病毒携带者病毒复制水平与外周血中TH17和Treg细胞相关细胞因子的关系

冯爱东，刘莲*，杨莉，金鹏，王慰，刘云燕(河北省石家庄市第五医院肝病科，河北 石家庄 050021)

[摘要]目的探讨HBV携带者外周血中Th17和Treg细胞相关细胞因子白细胞介素(interliukin，IL)-2、IL-10、IL-6、IL-17及转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)与体内病毒载量的关系。方法86例HBV携带者分为非活动性乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)携带者组、慢性HBV携带者HBV DNA低载量组和高载量组。采用荧光定量PCR技术检测HBV携带者血清HBV DNA。通过ELISA方法检测86例HBV携带者及39例正常人血清中IL-2、IL-10、IL-6、IL-17及TGF-β1含量。结果各患者组外周血清中IL-10含量均明显高于正常对照组(P<0.05)；HBV DNA低载量组和高载量组IL-2含量均明显高于正常对照组(P<0.05)，而非活动性HBsAg携带者组与正常对照组间差异无统计学意义(P>0.05)；各患者组外周血清中IL-6、IL-17及TGF-β1含量与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论HBV携带者体内随病毒载量的增高，与Th17、Treg细胞相关的细胞因子出现平衡紊乱，且慢性HBV携带者随病毒复制增多，免疫紊乱趋向加重。

[关键词]慢性乙型肝炎病毒携带者；Treg细胞；Th17细胞；细胞因子

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.12.017

慢性乙型肝炎呈世界性流行，我国1～59岁人群乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)携带率为7.18%，其中丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase，AST)在正常范围，肝脏组织学检查无明显异常或病变轻微者称携带者。但长期随访研究发现一部分乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)携带者会成为再激活患者，约占观察人数的15.9%，是否发病与肝脏炎症的程度有关[1]。目前已知，T细胞反应是控制HBV感染的关键[2-3]，其中调节性T细胞(Treg cells，Treg)和辅助性T细胞17(Thl7 cells，Th17)对肝脏炎症的调控成为研究的热点[4]。本研究对HBV携带者外周血中HBV载量及Treg、Th17相关细胞因子的含量进行检测，探讨不同病毒载量与HBV携带者体内Treg、Th17相关的细胞因子的关系，旨在为HBV携带者的免疫治疗最佳时机的选择提供理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料2012年10月—2013年3月在河北省石家庄市第五医院就诊的HBV携带者86例，男性64例，女性22例，年龄15～62岁，平均(37.42±12.59)岁，临床诊断均符合“慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)”的标准[5]，所有患者排除合并甲、丙、戊型肝炎，以及原发性肝癌、脂肪性肝炎、自体免疫性肝炎、长期嗜酒和特殊用药者，且患者均半年内未用过抗病毒药物和免疫调节剂，并均进行肝组织穿刺检查。HBV携带者根据病毒载量分组。其中非活动性HBsAg携带者18例，男性14例，女性4例，年龄24～61岁，平均(40.01±14.79)岁，选择标准为血清HBsAg阳性、HBeAg阴性，HBV载量(HBV DNA)<500 kU/L，1年内连续随访3次以上，ALT均在正常范围；肝组织学检查显示Knodell肝炎组织学活动性指数(histological activity index,HAI)<4或根据其他半定量计分系统判定病变轻微[5]。慢性HBV携带者68例，选择标准为血清HBsAg阳性、乙型肝炎e抗原(HBeAg)阴性、乙型肝炎e抗原(HBeAb)阳性或阴性，HBV DNA定量>103kU/L，1年内连续随访3次以上均显示血清ALT和AST在正常范围，肝组织学检查无明显异常[5]。慢性HBV携带者依据病毒载量高低又分为2个亚组：一组为HBV DNA低载量组33例，男性24例，女性9例，年龄15～62岁，平均(38.88±12.91)岁，血清中HBV DNA载量103～105kU/L；另一组为HBV DNA高载量组35例，男性26例，女性9例，年龄19～56岁，平均(37.83±11.64)岁，血清中HBV DNA载量值>105kU/L。同时选择门诊体检正常对照者39例，男性29例，女性10例，年龄18～61岁，平均(37.42±12.23)岁。各组性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2试剂及仪器白细胞介素(interliukin，IL)-6、IL-10、IL-17、IL-2、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)检测的酶联免疫吸附测定(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)试剂盒购自美国R&D公司，HBV核酸定量(HBV DNA)检测试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司，HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、乙型肝炎核心抗体(Hepatitis B core antibody,HBcAb)检测的试剂盒购自上海科华生物工程有限公司，ALT、AST试剂购于日本积水株式会社公司，DENLEY DRAGON Wellscan MK 3型酶标仪由芬兰Thermo生产，7300型荧光定量PCR仪由美国ABI公司生产，C8000型生化分析仪由美国雅培公司生产。

1.3研究方法

1.3.1外周血清中细胞因子含量的检测采用无菌真空干燥管无菌抽取患者及健康者外周静脉血2 mL，3 000 r/min离心5 min，分离血清，采用ELISA法测定外周血清中IL-6、IL-10、IL-17、IL-2、TGF-β1的含量，所有实验步骤严格按试剂盒说明书操作。

1.3.2外周血HBV DNA定量检测应用乙二胺四乙酸(ethylenediarne diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝管抽取健康者及患者外周静脉血2 mL，3 000 r/min离心5 min，分离血浆，采用荧光定量PCR法检测血浆中HBV DNA的含量，实验步骤严格按照实验室要求及试剂说明书操作。

1.3.3外周血HBV标志物的检测采用无菌真空干燥管无菌抽取患者及健康者外周静脉血2 mL，3 000 r/min离心5 min，分离血清，采用ELISA法检测外周血清中HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb含量，严格按试剂盒说明书操作。

1.3.4外周血生化指标的检测应用无菌真空干燥管抽取患者及健康者外周静脉血2 mL，3 000 r/min离心5 min，分离血清，采用大生化速率法对血清中ALT及AST含量进行检测，实验步骤严格按自动生化仪操作规程操作。

2结果

非活动性HBsAg携带者组和慢性HBV携带者中HBVDNA低载量组和HBVDNA高载量组外周血清中IL-10含量均明显高于正常对照组(P<0.05),HBVDNA低载量组和HBVDNA高载量组外周血清中IL-2含量均明显高于正常对照组(P<0.05)，各组IL-6、IL-17和TGF-β1含量差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1各组外周血中细胞因子含量比较

组别 例数IL-10IL-6IL-2IL-17TGF-β1正常对照组393.34±1.4920.49±12.839.43±8.667.69±3.56240.17±42.41非活动性HBsAg携带者189.13±6.85*22.00±15.5912.46±9.115.74±3.19243.25±61.34慢性HBV携带者 HBVDNA低载量组3311.59±6.94*29.46±19.7615.48±11.83*8.37±6.59250.43±58.62 HBVDNA高载量组3511.12±8.68*28.62±16.0817.41±15.13*9.15±7.86264.93±56.71 F12.9552.6173.0551.4341.420 P0.0000.0540.0310.2360.240

*P<0.05与正常对照组比较(SNK-q检验)

3讨论

据乙型肝炎流行病学调查推算，我国乙型肝炎感染者约9 300万，处于发病状态的慢性乙型肝炎患者约2 000万，其中HBV携带者占多数[5]，故HBV携带者的治疗一直倍受关注。目前研究认为，慢性乙型肝炎主要是免疫损伤所致，患者自身的免疫状态与慢性乙型肝炎的临床症状、体征、转归等有密切关系。Treg细胞和Th17细胞为新近发现的细胞，在功能上互相拮抗，在HBV感染免疫中的作用成为研究的热点[6]。Treg细胞为一种具有免疫抑制功能的T淋巴细胞，在维持免疫系统稳定状态及引发免疫耐受中发挥重要作用[7]。慢性乙型肝炎患者外周血Treg可以抑制HBV特异性的细胞免疫应答反应，使病毒不能及时被清除，可能是引发HBV慢性感染的发病机制之一[6]。目前有研究发现慢性HBV携带者体内Treg细胞表达量高于非活动性HBsAg携带者，且均高于健康正常者[8]。可见不同类型的HBV携带者体内 Treg细胞的免疫状态可能存在差异。Treg细胞主要通过分泌 IL-10、TGF-β1等细胞因子发挥免疫抑制作用，保护宿主免于炎症性病理损害[9]。本研究结果显示HBV携带者各组血清中IL-10含量均明显高于正常对照组，差异有统计学意义；而TGF-β1含量与正常对照组相比虽然差异不显著，但是亦表现一定程度增高，且随患者体内病毒载量增加，这两种细胞因子的含量不断增高，尤其IL-10增高显著。这与潘宗琴等[8]研究HBV携带者体内Treg细胞数量增高趋势一致。由此可见，HBV携带者体内Treg细胞通过IL-10等细胞因子抑制细胞免疫应答的功能明显增强，这可能是HBV携带者体内病毒不能被清除的机制之一。本研究慢性HBV携带者体内IL-10、TGF-β1含量与非活动性HBsAg携带者相比虽然差异无统计学意义，但是慢性HBV携带者体内IL-10、TGF-β1含量有一定程度增高。可见随病毒的含量增加，HBV携带者体内Treg细胞的抑制细胞免疫的功能不断增强。另有研究发现细胞因子IL-2对于 Treg 细胞功能的发挥是必需的，IL-2参与诱导初始 CD4+T 淋巴细胞向CD4+CD25+T淋巴细胞转化并促进Foxp3的表达，使其具备CD4+CD25+T淋巴细胞的特性[7]。而Foxp3为Treg发育和功能获得的决定因素，本研究结果显示患者组血清中IL-2的含量随病毒含量增加不断升高，尤其慢性HBV携带者HBV DNA低载量组、高载量组与正常对照组相比均明显增高，差异有统计学意义。可见随病毒复制增多，患者体内的细胞因子的环境更有利于CD4+T细胞向Treg细胞转化并发挥免疫抑制功能,这可能是潘宗琴等[8]发现的慢性HBV携带者体内Treg细胞表达量高于非活动性HBsAg携带者，且均高于健康正常者的原因之一。

Th17细胞是不同于Th1和Th2的效应T细胞，特异性分泌IL-17，介导炎症反应并在自身免疫性疾病中发挥重要的作用[10]。IL-17在固有免疫应答和适应性免疫应答中均发挥抗感染作用，是T细胞诱导的炎症反应的早期启动因素，在炎症的发生发展过程中起促进作用[11]。本研究发现各患者组血清中IL-17的含量与正常对照组相比差异无统计学意义，非活动性HBsAg携带者甚至低于正常对照组的趋势，但是随病毒载量的增加，各患者组血清中IL-17的含量呈增高趋势，尤其慢性HBV携带者体内IL-17的含量高于正常对照组。可见随病毒复制活跃，Th17细胞的产生开始增多。IL-6 亦为体内重要的致炎性细胞因子，在感染等多种因素刺激下，T淋巴细胞和单核巨噬细胞可被激活，从而使IL-6合成和释放增多，进一步促进激活的T淋巴细胞增殖，刺激未成熟的胸腺细胞分化为成熟的CTL，促进清除细胞内病毒，但是也增强了肝脏的炎症反应，加重肝细胞的损伤[12]。本研究结果显示HBV携带者外周血清中IL-6的含量随病毒含量增高呈逐渐升高趋势。由此可见随病毒载量增多，HBV携带者体内IL-17及IL-6这些炎症因子均有增多趋势，表明HBV携带者虽然肝功能表现正常，可是潜在的促进炎症发生的因素不断增多，即慢性HBV携带者的炎症发生可能性强于非活动性HBsAg携带者，但是这些因素往往由于患者无明显体征，所以很容易被患者忽视。这可能就是近年研究发现HBV携带者成为再激活患者，甚至发展为肝硬化、肝癌的风险更高的机制之一。所以，对于慢性HBV携带者更应该关注其肝损伤方面的指标变化，防止病毒再激活病情出现变化。

Treg细胞和Thl7细胞来自同一个前体细胞，均由CD4+T淋巴细胞分化而来，这两种细胞的分化途径具有互逆性，在不同的细胞因子作用下，未分化的 Th细胞向着不同的方向分化。目前的研究显示这两种细胞的分化主要依赖于机体固有免疫系统的状态以及IL-6 的产量。当机体处于稳定状态或者没有炎症损伤的情况时，免疫系统产生的TGF-β抑制效应T淋巴细胞的增殖，诱导未分化的Th细胞向Foxp3+Treg细胞分化，维持机体的免疫耐受状态。但当机体发生感染或炎症时，急性期蛋白IL-6大量产生，抑制Treg细胞的增殖，与TGF-β共同诱导未分化的Th细胞向Thl7细胞分化[13]，TGF-β1为执行TGF-β功能的主要亚型。本研究结果显示HBV携带者无论是非活动性HBsAg携带者还是慢性HBV携带者其TGF-β1和IL-6的含量与正常人之间差异无统计学意义。此时患者体内Th细胞主要是向Treg细胞分化，患者主要表现免疫耐受的状态，这也与近年研究发现乙型肝炎患者体内Treg细胞数量比正常人明显增多的结论一致[14]。但是从Th17细胞的特征性细胞因子IL-17的含量显示，虽然患者组与正常对照组差异不大，但是随慢性HBV携带者体内病毒含量增高，IL-17及IL-6显示不断升高的趋势。可见随HBV复制活跃，慢性HBV携带者体内趋向Th17细胞分化增多。这与胡月明等[15]研究中HBV感染后随着疾病的发生发展，外周血Th17 细胞明显增高的结果一致。

总之，从相关细胞因子的表达来看，HBV带者虽然肝功能正常，但是体内确实存在Th17/Treg平衡的紊乱。非活动性HBsAg携带者免疫状态比较稳定，主要是Treg细胞抑制功能有所增强，慢性HBV携带者存在免疫紊乱，不仅Treg细胞抑制免疫反应的功能有增强趋势，且患者体内细胞因子环境有利于Treg细胞的生成，同时随病毒复制增多，与Th17相关的细胞因子IL-17及IL-6亦有增多趋势，表明Th17细胞分化趋向增多，患者体内发生炎症的因素增多。所以，对于HBV携带者，尤其慢性HBV携带者应密切观察，当HBV携带者体内出现HBV病毒复制增加时，是否可考虑进行免疫调节治疗，促使Th17/Treg平衡紊乱恢复，达到患者自身免疫系统进行抑制病毒复制的目的，这可作为对HBV携带者治疗方法探索的一个思路。

[参考文献]

[1]陆忠华，陈卫，王娟华，等.220例慢性乙型肝炎病毒携带者病理特点及5年随访[J].南京医科大学学报:自然科学版，2009，29(4)：530-533.

[2]Ye B,Liu X,Li X，et al.T-cell exhaustion in chronic hepatitis B infection:current knowledge and clinical significance[J].Cell Death Dis，2015,6(3):e1694.

[3]王慰，郑欢伟，员美娜，等.慢性乙型肝炎病毒感染者外周血T细胞亚群变化与血清HBV DNA水平分析[J].河北医科大学学报，2012,33(12):1430-1432.

[4]Chen Y,Fang J,Chen X，et al.Effects of the Treg/Th17 cell balance and their associated cytokines in patients with hepatitis B infection.[J].Exp Ther Med,2015,9(2): 573-578.

[5]中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].中华肝脏病杂志，2011,19(1):13-24.

[6]Niu Y,Liu H,Yin D,et al.The balance between intrahepatic IL-17(+)T cells and Fox3(+)regulatory T cells plays an important role in HBV-related end-stage liver disease[J].BMC Immunology,2011,12：47.

[7]Walecki M,Eisel F,Klug J,et al.Androgen receptor modulates Foxp3 expression in CD4+CD25+Foxp3+regulatory T-cells [J].Mol Biol Cell，2015,26(15):2845-2857.

[8]潘宗琴,吕红,胡世芸,等.外周血CD4+CD25+Treg细胞与HBV携带者相关性的Meta分析[J].世界华人消化杂志，2013,21(29)：3124-3131.

[9]刘光亮，周小兰，陶鹏,等.Th17/Treg细胞亚群数量变化在HBV相关ACLF临床转归中的作用[J].免疫学杂志，2014,30(7)：623-627，635.

[10]王晨宇，王星，王琳，等.Th17细胞分化调节机制及与自身免疫性疾病关系研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志，2014，30(6)：660-662.

[11]林振忠,余雪平,苏智军，等.慢性乙型肝炎患者外周血 Treg/Th17 比率的检测及其与肝功能的相关性研究[J].中国免疫学杂志，2012，28(11)：1036-1040.

[12]齐育英,林振忠,明德松.IL-6、IL-10、IL-17 在慢性乙型病毒性肝炎患者血中水平分析[J].中国免疫学杂志，2013,29(11):1177-1180.

[13]Zhou L,Lopes JE,Chong MM,et al.TGF-beta induced Foxp3 inhibits Th17 cell differentiation by antagonizing RORgammat function[J].Nature，2008，453(7192):236-240.

[14]詹爱琴，刘佩芝，左维泽.慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞与转化生长因子 β1 水平变化及其意义[J].中国全科医学，2010，13(36)：4066-4068.

[15]胡月明，马莉，李虹.HBV 感染者外周血 Th17细胞和 Treg细胞的检测及意义[J].检验医学，2014，29(1)：21-25.

(本文编辑：许卓文)

[中图分类号]R512.62

[文献标志码]B

[文章编号]1007-3205(2015)12-1428-04

[作者简介]冯爱东(1969-),女，河北石家庄人，河北省石家庄市第五医院副主任护师，医学学士，从事临床护理学研究。*通讯作者。E-mail：Liulian13303110809@163.com

[基金项目]河北省科学技术研究与发展计划(12277705D)

[收稿日期]2015-05-28；[修回日期]2015-07-27