付伟 邓莉兰 徐胜 何兴元 陈玮 赵诣 张娜 苏丽丽

(西南林业大学，昆明，650224) (森林与土壤生态国家重点实验室(中国科学院沈阳应用生态研究所))

责任编辑:潘 华。

臭氧(O3)是常见的植物性毒素空气污染物。政府间气候变化专门委员会第四次评估报告指出［1］，自工业革命以来，由于O3前体物如氮氧化物(NOx)、一氧化碳(CO)、挥发性有机气体(VOCs)等排放增加［2］，对流层中O3摩尔分数在近30 a来以每年0．5%～2．0%的速度上升，预计到2100年O3摩尔分数可达84×10－9。受污染地区的局地较高地表温度将会触发区域化学和局地排放反馈，进一步推高臭氧峰值水平［3］。我国京津唐和长江三角洲等地区近地层O3短期摩尔分数最高已达到150×10－9［4－5］，对人和动植物造成严重影响。目前全球森林的30%已遭受到O3的不利影响，预计到21世纪末将达到49%［6］。高摩尔分数O3已被证实对植物生理功能、生长发育、产量等造成显著负面影响［7－10］。

气孔是陆生植物与外界环境气体交换和水分交换的主要通道及调节器官［11］，气孔虽小，但对植物水分利用、营养吸收、物质代谢等方面以及整个生态环境的调节起重要作用［12］。气孔大小及气孔开度大小决定了进入植物体内O3的量，其变化与O3对植物的伤害关系较大［13］。高摩尔分数O3对植物气孔影响已有的研究表明，O3摩尔分数升高胁迫下植物叶片的气孔结构受到损伤，气孔开度降低、密度增大等［13－15］。徐文铎等［16］对银杏和李梅等［17］对水蜡的研究表明，O3摩尔分数升高下两树种成熟叶片气孔密度无显著变化。Paoletti［18］用110×10－9摩尔分数O3对草莓树(Arbutus unedo)熏蒸90 d后发现其气孔开度未显著降低。Paoletti和Grulke［19］对食荚菜豆(Phaseolus vulgaris)和加州栎(Quercus kelloggii)等3种植物的研究发现，摩尔分数为70×10－9O3胁迫1～2个月后它们的气孔开度反而增大，并认为其原因是高摩尔分数O3会延迟气孔反应时间，增加气孔开闭时间，有些气孔夜间仍处于不完全关闭状态。相关研究结果存在较大差异，很难准确评价O3胁迫对植物气孔运动影响，同时也不利于评价O3对不同植物的影响和危害。

黄檗(Phellodendron amurense Rupr．)是我国东北地区3大硬阔叶树种之一，在沈阳已被广泛应用于城市园林绿化。目前对黄檗已有较多的研究，但多集中在化学成分及药物等方面［20］，生理生态等方面研究较少［21－22］。而有关大气O3摩尔分数升高对黄檗气孔特征等的影响研究还未见有报道。本试验旨在研究高摩尔分数O3胁迫下黄檗叶片气孔特征影响，揭示O3胁迫对叶片气孔的影响，为更好评价高摩尔分数O3对植物的危害提供理论依据，同时也为全球气候变化背景下珍贵植物黄檗的种质保护、开发及利用提供科学依据和实践指导。

1 材料与方法

研究区位于中国科学院沈阳树木园内，是沈阳市人口密集的商业文化中心地带。本试验采用开顶箱(OTC)气体熏蒸法，试验主要设施为结构和性能完整的4个OTCs(直径4 m、高3 m的正八边形玻璃室壁)及与其配套的通气、通风设备。试验于2013年7—9月进行，设置对照组AA(背景大气，约((40±5)×10－9)和3组不同摩尔分数O3处理，设定值依次为T1((60±5)×10－9)、T2((80±10)×10－9)和T3((120±10)×10－9)。

2013年5月底将4年生黄檗(Phellodendron amurense Rupr．)幼苗重新移入上口径28 cm，高30 cm的塑料花盆内，培养基质为V(壤土)∶V(草炭)∶V(沙土)=5∶3∶2的混合土壤，温室培养60 d后，于2013年7月31日选取生长状况良好，高度基本一致的盆栽黄檗幼苗移入OTCs内，每个摩尔分数的OTC内放置3盆作为重复并开始通气处理，熏蒸时间为每天09:00—16:00(雷雨天等恶劣天气停止通气)，9月25日停止通气，共处理56 d。整个熏蒸处理期OTCs内管理方法一致，水肥等条件控制一致。

可见伤害症状:对高摩尔分数O3熏蒸下黄檗叶开始出现可见症状进行观察和记录，并于气体熏蒸第49 d时统计可见伤害(出现坏死性斑块等症状的面积)百分比。单叶可见伤害比通过随机选取各OTC内黄檗幼苗的叶片(5片/株)，用Photoshop CS5计算得出;单株叶片可见伤害比=观察到可见症状的叶片数/植株全部叶片数(含幼叶和成熟叶)。

扫描电镜观察:不同摩尔分数O3熏蒸56 d后，在9月25日(晴天)上午10:00时左右采集各开顶箱内黄檗幼苗形态学上部、奇数羽状复叶中部发育阶段相近的新生成年叶片，每株黄檗幼苗选取2片大小均匀，无病虫害的叶片(80×10－9、120×10－9摩尔分数O3开顶箱内采集的叶片有坏死斑)。将取下的叶片迅速用蒸馏水轻轻漂洗后，用锋利刀片将叶片中脉两侧(中部)的部分，各切下约6 mm×6 mm的小块2块，放入装有2．5%戊二醛的透明玻璃小瓶固定，于冰箱4℃保存。显微观察前，将经戊二醛固定的叶片样品用磷酸缓冲液(pH=7．2、0．1 mol·L－1)清洗3次，然后用70%、80%、90%、95%、100%5个体积分数酒精脱水，各梯度均脱水5 min，最后用纯叔丁醇置换2次。再用国产LGJ－10c型冷冻干燥机真空冷冻干燥，待自封袋内的冰晶挥发后取出，将切好的样品用双面胶固定到样品台上，再用精密刻蚀喷镀仪镀金后置于环境电子扫描显微镜(Quanta－250，国产)下进行观察拍照。每个处理观察30个视野(600倍、5 000倍)并拍照。计算每幅图片上的气孔个数，除以该图片面积，统计每1 mm2叶片上的气孔数目，即为气孔密度。同时，在单个气孔(5 000倍)图片上测量各气孔的长度、宽度、周长、面积及气孔开放口的长度和宽度。气孔长度为平行于气孔器的最长值，气孔宽度为垂直于气孔器的最宽值，气孔面积通过Photoship CS5算出;气孔比=气孔长度/气孔宽度［16－17］。所有数据采用Microsoft Office Excel 2007和PASW 18．0软件统计分析，相关性分析采用(Pearson，two－tailed)分析得出。

2 结果与分析

2．1 高摩尔分数O3对黄檗叶片可见伤害症状的影响

高摩尔分数O3(120×10－9)熏蒸6 d后(第6天症状出现时的臭氧伤害剂量为29．60 mmol·mol－1·h－1，典型伤害症状为叶片边缘及近中脉首先出现漂白色褪绿斑点，随着熏蒸时间延长，斑点逐渐扩大成斑块，颜色变为黄褐色，其余部分变黄。)对黄檗叶片开始产生可见伤害症状。症状先出现在叶边缘及近中脉，并随熏蒸时间的延长而加剧，表现出积累效应。

不同摩尔分数O3熏蒸49 d后，与对照相比，80×10－9和120×10－9两处理组黄檗单叶伤害面积比和单株叶可见伤害比极显著增加(P＜0．01)(表1)，增幅分别为48．2%、77．7%和96．2%及62．4%。而O3摩尔分数为60×10－9时差异不显著(P＞0．05)。表明黄檗对小于80×10－9摩尔分数O3表现出一定的抗性。

表1 不同摩尔分数O3对黄檗叶片可见伤害率的影响 %

2．2 高摩尔分数O3对黄檗叶片气孔大小参数的影响

从扫描电镜观察的结果来看(图1)，黄檗气孔分布于叶片的下表皮，散生于叶脉间，各处理组气孔呈近椭圆形，气孔外拱盖隆起，气孔外拱盖内缘近平滑［23］。但经过56 d的不同摩尔分数O3熏蒸处理后，黄檗叶片气孔大小参数发生显著变化(表2)，具体表现为:与对照组相比，摩尔分数为120×10－9处理组气孔长度和宽度均极显著降低(P＜0．01)，降幅分别为17．47%和21．44%。摩尔分数为80×10－9组气孔宽度显著降低34．4%，但气孔长度降低不显著(P＞0．05)。T2、T3组气孔开度长和开度宽亦极显著降低(P＜0．01)，降幅依次为21．45%、24．03%及57．40%、53．03%。摩尔分数为80×10－9、120×10－9组的气孔周长和气孔面积也呈现出极显著降低趋势(P＜0．01)，呈现O3摩尔分数越高，降幅越大的趋势。两组处理的气孔周长降幅分别为12．87%和21．70%，气孔面积降幅分别为34．6%和45．5%。对各组的气孔周长和气孔面积进行相关性分析表明，除了对照组的气孔周长和气孔面积存在显著的正相关外(n=15，R2=0．67，P＜0．05)，各处理组两变量之间均存在极显著的正相关性(n=15，P＜0．01)。O3摩尔分数60×10－9处理下，黄檗叶片下表皮气孔大小参数变化幅度较小，除气孔宽度和开口宽与对照相比显著降低外(P＜0．05)，降幅为12．0%和27．9%。其它各指标略降低，但均无显著变化(P＞0．05)。气孔大小参数与臭氧摩尔分数之间的相关性可以用一元二次曲线方程较好的描述(P＜0．01)。

表2 不同摩尔分数O3对黄檗叶片气孔大小参数影响

2．3 高摩尔分数O3对黄檗叶片气孔密度和气孔比的影响

不同摩尔分数O3熏蒸处理56 d后，与对照相比，80×10－9、120×10－9摩尔分数下黄檗叶片气孔密度极显著增加(P＜0．01)(表3)，分别增加37．26%和35．12%，两组摩尔分数间差异不显著;60×10－9摩尔分数下的气孔密度变化不显著(P＞0．05)。

表3 不同摩尔分数O3熏蒸下黄檗叶片下表皮气孔密度和气孔比的变化

随O3摩尔分数升高，黄檗叶片的气孔比呈逐渐增加趋势，当O3摩尔分数增加到80×10－9时，气孔比达到最大的3．52，与对照相比极显著增加41．31%，之后气孔比有降低的趋势，但仍与对照呈极显著差异(P＜0．01)，增幅为37．23%。表明高摩尔分数O3胁迫对黄檗叶片气孔数量和大小发育影响作用较大，且在80×10－9时气孔密度和气孔比达到最大。

3 讨论与结论

叶片可见伤害症状是植株在高摩尔分数O3环境中受到伤害后表现出的直观症状，这种症状主要是由于O3通过叶下表皮开放的气孔进入组织细胞中并与细胞壁和质膜上的物质反应而产生，阔叶树种往往表现为叶片变红或变褐色，但因树种不同而异［6，24－25］。Vapaavuori等［26］研究发现O3伤害剂量达到28 mmol·mol－1·h－1时垂枝桦叶片出现可见伤害症状。本试验中，黄檗叶片在高摩尔分数臭氧熏蒸下6 d、O3伤害剂量为29．6 mmol·mol－1·h－1时出现漂白色的可见伤害症状，并随着熏蒸时间延长伤害加剧。O3摩尔分数高于80×10－9时对黄檗单叶伤害面积比和单株叶可见伤害比极显著增加，而低于该摩尔分数时变化较小。表明黄檗对低于80×10－9摩尔分数O3表现出一定的抗性。

图1 不同摩尔分数O3处理黄檗叶片下表皮气孔的扫描电镜观察(×5000)

在全球气候变化背景下，当植物叶片出现可见伤害症状时，用显微观察分析确认，可能成为O3或其他污染物胁迫下植物诊断的有效手段，同时也能评估不同树种在不同胁迫因子下的适应能力［15］。气孔是控制CO2进入叶肉细胞和水分蒸腾散失的重要门户，气孔的变化会对植物的生长产生重要影响。已有的研究表明，O3胁迫对垂枝桦(Betula pendula)和土豆叶片细胞和气孔结构造成损伤［14，27］。文志等［13］研究表明，高摩尔分数O3(约100×10－9)熏蒸处理110 d元宝枫叶片气孔大小参数显著下降。本研究表明，与对照相比，80×10－9、120×10－9摩尔分数O3处理下黄檗幼苗叶片的气孔长度、宽度、气孔开度及气孔周长和面积均显著下降(P＜0．01)(除80×10－9时气孔长降低不显著外)，且O3摩尔分数越高，降幅越大，并有少数气孔出现完全闭合现象。而60×10－9摩尔分数处理时其气孔宽度和气孔开口宽下降明显，其他气孔大小参数变化较小(P＞0．05)。各处理组气孔周长与气孔面积之间存在极显著的正相关，气孔周长和面积相互影响。产生这种现象的原因可能是O3进入植物细胞后，诱导植物叶片细胞内(包括保卫细胞)产生H2O2，H2O2作为信号分子与下游信号分子级联反应导致气孔关闭［28］。李梅等［17］对水蜡的研究得出类似结果。但Paoletti［18］和Grulke［19］对加州黑栎等3种植物的研究发现，不管稳态光还是动态光下，O3胁迫后它们的气孔开度反而增大，认为高摩尔分数O3会延迟气孔反应时间，气孔开闭时间增加，有些气孔夜间仍处于不完全关闭状态。Hassan等［29］通过对埃及萝卜的研究发现，高摩尔分数O3能引发其表皮细胞部分破裂，从而导致气孔开度增大。因此，相比气孔指数，气孔密度值更能反映出大气O3摩尔分数升高对气孔数量变化的关系［16］。本研究中，80×10－9和120×10－9摩尔分数O3处理下黄檗幼苗叶片的气孔密度显著增加(P＞0．01)，两组处理间无显著差异，60×10－9摩尔分数处理时增幅不显著(P＞0．05)。这与Giacomo等［15］研究结果一致。徐文铎等［16］对银杏和李梅等［17］对水蜡的研究结果表明O3摩尔分数升高处理下叶片气孔密度未显著增加，认为取样的材料是成年叶片，而气孔产生和形成是在叶片发生早期，本实验中高摩尔分数O3处理下黄檗叶片气孔密度的增加可以认为是一种有益的生理生态适应机制的表现，通过减轻单个气孔对O3的负荷，使O3在叶内组织均匀分布，从而形成一个良好的排毒过程［30］，黄檗在80×10－9左右O3摩尔分数时能通过调控气孔发育等积极响应来适应变化的环境，从而减少伤害。这也表明不同树种对O3摩尔分数的敏感性存在差异，O3摩尔分数对气孔性状的影响与控制试验的时间长短或植物的种类有关，同时也表明植物既可以短期调节气孔开度又可以长期控制气孔发育和形态来适应环境的变化［12］。气孔比随O3摩尔分数升高增大，80×10－9时达到最大，随后降低。进一步分析发现，80×10－9摩尔分数O3处理下气孔在气孔长度较大的情况下，气孔宽度显著降低，而气孔宽度的降低又是通过最大程度的降低气孔开度(表3)。这说明O3对植物影响有累积性，黄檗可以忍耐低于80×10－9的O3摩尔分数，当黄檗O3积累吸收量超过了自身解毒能力，气孔结构受损，其发育受到影响。

综上所述，高摩尔分数O3熏蒸黄檗幼苗叶片产生明显漂白色褪绿斑点等伤害症状，并随熏蒸时间延长而加剧。经过56 d熏蒸处理，O3摩尔分数为60×10－9时黄檗叶片下表皮气孔宽度和开口宽显著减小，而气孔周长等其他参数无显著变化。当O3摩尔分数上升到80×10－9和120×10－9时，其气孔大小极参数显著降低。气孔密度和气孔比在80×10－9时达到最大。推测(80±10)×10－9是黄檗幼苗O3胁迫忍耐性的临界点。

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