黄 娟，卢沛明

(国家青少年食品质量监督检验中心/中食检测研究院有限公司，广东东莞 520808)

维生素B12是唯一一类含有主要矿物质钴的维生素，故又名钴胺素，包括氰钴胺、羟钴胺、甲钴胺、腺苷钴胺。通常狭义上所指维生素B12是氰钴胺，它是食品和营养补充剂中B12的主要形式。B12易溶于水，在吸收时需要与钙结合，大部分为小肠所吸收，人体只能利用甲钴胺和腺苷钴胺，因此氰钴胺要在体内细胞转化成这两种形式才能被人体吸收利用。婴幼儿缺乏维生素B12表现为精神情绪异常、表情呆滞、反应迟钝等，最后导致贫血［1］;婴幼儿过量摄入维生素B12则易导致叶酸缺乏，有些会出现哮喘、湿疹、荨麻疹、面部水肿等过敏性症状。因此我国标准对婴幼儿品配方乳粉中B12的添加量有严格的规定，其中GB 14880—2012《食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》［2］中儿童调制乳粉中B12的添加量为10～30μg/kg，相关产品国标标准添加限量也在此范围。目前市售婴幼儿乳粉是营养标签中B12的含量大部分在1.5～2.5μg/100g 之间。

现行标准GB 5413.14—2010《婴幼儿食品和乳制品中维生素B12测定方法》［3］采用微生物法，但由于测定周期长、技术难度较大等缺点，大部分的检验机构不能较好地开展。而另一现行标准GB/T 5009.217—2008 《保健食品中维生素B12的测定》［4］的前处理过于简单，对婴幼儿乳粉的除杂、提取效果不佳，检出限(0.05μg/g)达不到要求，因此也不适用。笔者根据婴幼儿乳粉的成分特点，对GB/T 5009.217—2008 的前处理过程进行改进，降低了基体杂质的干扰，提高了检测的灵敏度，实验过程简单易掌握，能满足日常婴幼儿乳粉中B12含量的检测要求。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 高效液相色谱仪(U-3000，美国Thermofisher 公司)，带紫外检测器;离心机(Sorvall ST16，美国Thermofisher 公司);氮吹仪(DC-24，上海安谱科学仪器有限公司);固相萃取装置(20-Positiion Extraction Manifold，Waters 公司);免疫亲和柱(EASI-EXTRACT vitaminB12，60mg，3mL，德国拜发公司)。

1.1.2 试剂 乙腈(色谱纯，Honeywell)、甲醇(色谱纯，Honeywell)乙酸钠(AR，广州试剂厂)、三氟乙酸(AR，广州试剂厂);维生素B12标准品(96.2%，Dr.Ehrenstorfer)。

1.2 色谱条件

色谱柱:Hypersil GOLD 250 ×4.6mm，5μm;柱温30℃;流动相:乙腈和水(15∶85)，梯度洗脱(表1);流速0.25mL/min;紫外检测器361nm，进样量10μL。

表1 流动相梯度

1.3 样品前处理

称取试样5.000g (精确到0.001g)于50mL 容量瓶中，加入30mL 乙酸钠缓冲溶液(50mmol/L，pH4.0，40℃)振摇混匀后，用乙酸钠缓冲溶液定容。超声提取15min，然后将提取液用滤纸过滤，取滤液30mL 待净化。免疫亲和柱放置在固相萃取装置上，待柱中原缓冲溶液流完时立即倒入滤液，以2mL/min 的速度流出，弃去流出液，并用10mL 纯水以5mL/min 的速度洗涤柱子，待水流完，用洗耳球吹干免疫亲和柱。用5mL 甲醇以1 滴/s 的速度洗脱目标物，并置于氮吹仪上(60℃)吹干。加200μL 纯水定容后上机。标准品谱图见图1、样品谱图和加标样谱图见图2。

图1 维生素B12标准品谱图

图2 乳粉中维生素B12谱图(A 图为样品、B 图为加标样)

2 检测条件的优化

2.1 流动相的选择

按照GB/T 5009.217—2008 中流动相为0.025%三氟乙酸(pH 值为2.6)和乙腈，笔者将0.025%三氟乙酸(pH 值=2.6)换成纯水，实验结果显示目标物的相应没有发生明显的变化。考虑到流动相pH 偏低对色谱柱的寿命有影响，故将流动相调整为水和乙腈。

2.2 流速的选择

通常高效液相色谱的流动相流速为1mL/min，笔者尝试比较不同流速时目标物的相应发现，随着流动相流速的降低，目标物的灵敏度和响应显著增加(图3)。相同浓度的标准品，在不同流速下，标准品的峰高从1.855 上升到2.690，峰面积也增加110%。考虑到实验总消耗时限，选择0.25mL/min 作为最终方法确认的实验条件。

图3 不同流动相流速时维生素B12谱图

3 结果与分析

3.1 线性范围和检出限

称取标准物质，5%乙醇水配制浓度为1mg/mL 的标准储备溶液，然后用水稀释成浓度为0、0.01、0.02、0.10、0.20、0.50、1.00μg/mL 的标准工作溶液。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标得到标准曲线Y=0.520 8 +0.000 7，相关系数r=0.999 9，说明在0.01～1μg/mL范围内具有良好的线性关系。噪比为3 时，样品中最低检出浓度为5μg/kg。

3.2 准确性

取婴幼儿乳粉样品，按照1.3 中步骤处理样品，同时进行3 个水平加标实验(表2)，测定样品的加标回收率80.0%～90.0%，符合GB 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F 中＜0.1mg/kg 的组分含量回收率范围在60%～120%的要求。

表2 回收率测定结果

3.3 方法的重复性与稳定性

取不同浓度的样品分别进行测定6 次(表3)，测定结果的相对标准偏差(RSD)为0.3%～1.6%，说明本方法重复性好。将处理好的样品放入4℃的冰箱中避光保存，在12h 内测定结果未见有显著性差异。

表3 不同浓度样品重复测定结果

4 讨论

本文所建立的免疫亲和—高效液相色谱法较微生物检验方法来说，易于操作和掌握，重复性和稳定性较好，流动相的变化更有利于延长色谱柱的使用寿命，检出限能满足日常婴幼儿乳粉的检测，能应用在日常检验工作中，大大提高工作效率。

［1］王华，陈辉，李雪梅，等.维生素B12功能及营养作用研究［J］.中国食物与营养，2007，2:57-58.

［2］GB 14880—2012 食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准［S］.

［3］GB 5413.14—2010 婴幼儿食品和乳制品中维生素B12测定方法［S］.

［4］GB/T 5009.217—2008 保健食品中维生素B12的测定［S］.