孙平风，傅 芬

（南昌大学第二附属医院妇产科，江西南昌 330006）

肿瘤相关基因的异常与肿瘤的发生发展、治疗药物选择和预后评估密切相关，因此对其高灵敏度、高特异性的检测尤为重要［1］。大多数肿瘤相关基因异常表现为小缺失、点突变和插入突变，可由经典的、以PCR为基础的测序技术检测。然而，由于传统检测方法的限制，单个或多个外显子缺失/重复往往被忽视［2］。目前MLPA技术因精确度高、重复性好和操作简便等优势，广泛应用于肿瘤相关基因大片段缺失/重复的检测，成为肿瘤分子诊断领域的研究热点。本文介绍MLPA技术原理和方法，并从胚系突变及体细胞突变角度对MLPA技术用于肿瘤相关基因大片段缺失/重复的检测作一综述。

1 MLPA技术原理

MLPA技术是在多重扩增探针杂交（multiplex amplification and probe hybridization，MAPH）技术的基础上改进并设计的一种具有高通量、高敏感、高效率以及低成本，可对待检核苷酸序列定性和相对定量分析的基因分析技术［3］。其基本原理是特殊合成的探针与靶序列DNA杂交，通过杂交探针的连接、PCR扩增，得到的PCR产物再经毛细管电泳分离，收集数据分析最后得出结论（图1）。MLPA技术能够在一个简单的反应体系内检测多达50个核酸序列拷贝数的改变，目前已广泛应用于检测肿瘤相关基因大片段缺失/重复［4］。

2 MLPA用于检测肿瘤相关基因缺失/重复

肿瘤的发生、发展是一个复杂的多因素多步骤的过程，其中肿瘤相关基因异常而导致抑癌基因的失活和原癌基因的激活发挥重要作用。对肿瘤相关基因异常的检测，不仅有助于了解潜在的肿瘤发展分子机制，而且还提供了用于肿瘤的诊断和预后的重要信息，成为肿瘤学研究的主要方向［5］。MLPA技术可应用于不同类型肿瘤的分子生物学研究，主要体现在3个方面，胚系突变检测、体细胞突变检测和肿瘤抑制基因甲基化检测［1］，本文着重介绍前两个方面。

2.1 胚系突变

遗传性肿瘤因胚系突变导致肿瘤的遗传易感性，其中最具代表的是由BRCA1/BRCA2基因突变导致的乳腺癌/卵巢癌、由APC基因突变导致的家族性腺瘤性息肉病和因错配修复（MMR）基因突变导致的遗传性非息肉病性结直肠癌。对受遗传性肿瘤影响的患者及亲属鉴定上述提到的基因突变，并建立特殊的预防性措施极为重要。虽然大多数人类遗传性疾病是由DNA序列特定基因的点突变导致，但研究表明，在没有点突变存在的情况下，一部分存在基因片段缺失/重复［6］。

2.1.1 BRCA1/BRCA2基因与乳腺癌/卵巢癌:BRCA1/BRCA2是迄今为止研究较为确切的、与遗传性乳腺癌/卵巢癌最为相关的基因，携带这两种基因致病性突变的女性发生乳腺癌/卵巢癌的风险较普通人群明显增加［7］。最早在1997年，有研究者发现在乳腺癌家系中存在BRCA1基因的整个外显子或者多个外显子的缺失/重复［8］。鉴于乳腺癌易感基因BRCA1/BRCA2的胚系突变使女性患乳腺癌/卵巢癌的风险明显增加，一些国家已经在高危人群中开展针对这两种基因的遗传风险评估和遗传检测。

通过MLPA技术检测经变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）和直接测序法筛选无点突变的661个乳腺癌/卵巢癌高风险家系的BRCA1/BRCA2基因，在5个家系中发现5种不同的BRCA1缺失/重复序列［9］，此后多项研究［10-11］应用该方法发现不同人群中BRCA1/BRCA2基因外显子的缺失/重复，且人群不同BRCA1/BRCA2突变类型不同。

图1 MLPA探针结构和技术原理Fig 1 Probe structure and outline of the MLPA reaction

对中国人群乳腺癌/卵巢癌家系中 BRCA1/BRCA2基因检测发现存在BRCA1基因外显子17～20的缺失和BRCA2基因外显子21的缺失，经DNA测序证实了这些缺失，并在1例早期三阴性乳腺癌患者中检测到外显子1～12的删除突变［12］。这些大片段的缺失只能通过MLPA检测，建议当点突变检测为阴性时，应进行基因大片段缺失/重复检测，提高突变检出率，为遗传风险评估提供可靠的理论依据。

2.1.2 APC基因与家族性腺瘤性息肉病:家族性腺瘤性息肉病是一种罕见的常染色体显性遗传性疾病，如不及时治疗，几乎100%的患者发生癌变［13］。家族性腺瘤性息肉病的发生与APC基因突变有关，约60% ～80%的患者可以检测到APC基因点突变，阴性突变患者中10% ～15%为APC基因的大片段缺失性突变［13］。对家族性腺瘤性息肉病先证者检测APC基因点突变及大片段缺失突变，有助于发现高危人群，做到早发现、早诊断和早治疗。

有研究者对经DHPLC和直接测序法未检测到点突变的24例家族性腺瘤性息肉病先证者进行MLPA分析，发现4例存在APC基因的完全缺失，1例外显子4～15缺失、1例外显子7～15的缺失，缺失检出率达25%，这些大片段缺失既往均未见报道，提出直接测序联合MLPA对基因大片段缺失检测可提高APC基因胚系突变的检出率［6］。

2.1.3 MMR基因与遗传性非息肉病性结直肠癌:遗传性非息肉病性结直肠癌是一种常染色体显性遗传疾病综合征，由MMR基因胚系突变引起，已经明确 4种 MMR基因（hMLH1、hMSH2、hMSH6和hPMS2）种系微小突变可导致遗传性非息肉病性结直肠癌的发生［14］。1998年首先报道遗传性非息肉病性结直肠癌家系中hMSH2基因大片段缺失占hMSH2基因致病性突变的30%［15］，现已受到越来越过研究者的关注。

一项临床研究用MLPA技术检测78例遗传性非息肉病性结直肠癌患者hMLH1/hMSH2基因，发现15例存在基因组重排（包括14例缺失和1例重复），并行非荧光多重PCR联合高效液相色谱法验证得到一致的结论［16］。该研究表明hMSH2基因缺失更为常见，是遗传性非息肉病性结直肠癌不可忽视的分子遗传学重要特征之一，在分子遗传学检测中应加入缺失检测项目，必将对本病的早诊断、早治疗、优生优育以及对遗传性非息肉病性结直肠癌发病分子机制的认识有重大作用。

2.2 体细胞突变

目前，MLPA技术在肿瘤诊断、治疗及预后方面均有重要的作用［1］。胚系突变的检测有利于早期发现肿瘤高危人群和建立有效的预防措施，而应用MLPA检测体细胞肿瘤相关基因删除/重复突变旨在了解肿瘤发生发展机制、指导治疗及评估预后。

2.2.1 HER2基因与乳腺癌:HER2是乳腺癌预后、预测的指标和治疗靶点，目前没有任何一项检测技术能够完美地筛选出对抗HER2治疗受益人群。乳腺癌患者中约15%～20%存在HER2基因扩增或过表达［17］，HER2基因扩增是乳腺癌早期复发、转移的独立预后因子，更重要的是，HER2基因状态与重组人单克隆抗体曲妥珠和小分子酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼疗效有关［18］。由于曲妥珠和拉帕替尼治疗费用高，不良反应大，ASCO/CAP指南规定曲妥珠治疗仅适用于HER2过表达（蛋白表达2+以上）或者证实存在基因扩增的患者［19］。因此，准确、快速的检测HER2基因状态对乳腺癌患者临床治疗具有重大意义。

MLPA检测乳腺癌HER2扩增状态的准确率与当前检测基因扩增的金标准荧光原位杂交技术（florescence in situ hybridization，FISH）和显色原位杂交技术（chromogenic in situ hybridization，CISH）高度一致，且发现IHC 0/1+的乳腺癌患者存在HER2基因扩增，以及IHC 3+乳腺癌患者未检测到扩增［20］。MLPA是一种相对客观的检测手段，且与原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）技术相比检测费用更低，实现快速、准确和廉价的检测，且能根据石蜡标本中提取的少量DNA来评价HER2基因扩增状态，在临床中适用于筛选对曲妥珠治疗敏感的人群。

2.2.2 EGFR基因与胶质瘤:EGFR在多种肿瘤中存在基因扩增和高度表达，包括头颈部肿瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、肾癌和前列腺癌等［21］。EGFR存在多种突变类型，其中以EGFRⅢ型突变体（EGFRⅧ）最为常见，半数存在EGFR基因扩增的胶质瘤中可检测到该突变类型。与EGFR完整结构相比，丧失胞外配体结合区的EGFRⅧ可在没有配体结合的情况下，以二聚体化和自体磷酸化方式导致不受调控的激酶结构性激活，诱发下游信号传导，刺激肿瘤细胞增殖，被认为是癌性突变［22］。因此准确检测EGFR基因状态及EGFRⅧ对制定个体化综合治疗方案、预后评价及分子靶向治疗提供有力的理论依据。

通过MLPA技术检测EGFR基因扩增及EGFRⅧ，经蛋白水平的免疫组化（immunohistochemistry，IHC）和mRNA水平的RT-PCR验证，MLPA展现出与RT-PCR或IHC相媲美的敏感性和特异性，是可靠且相对容易操作的EGFR扩增及EGFRⅧ的检测方法，并在某些检测试剂盒中可与其他肿瘤相关基因同时检测［23］。但另有研究显示，RT-PCR和IHC对EGFRⅧ的检测比MLPA更敏感［21］。这可能是在胶质瘤中EGFRⅧ阳性细胞数量比EGFR阳性细胞数量少，DNA水平上，这种缺失突变在EGFR高度扩增的背景下不容易被发现。为了克服这一缺点，可联合使用激光显微切割技术增加肿瘤细胞的量来提高MLPA检测的准确率［24］。

3 MLPA技术存在的问题及展望

尽管MLPA技术有诸多优点，但目前也存在以下不足:对样本DNA的质量要求较高，不适合检测未知的点突变类型，不能检测染色体的平衡易位和倒位现象，且肿瘤细胞DNA容易被正常细胞DNA污染，从而减弱肿瘤特异基因拷贝数变化的幅度造成假阴性结果。

目前任何一种方法都无法同时检测微小突变与大片断缺失/重复，无法达到完善的检测效果，因此需要两种或两种以上检测方法结合。近年，国外研发特异性检测EGFR 21号外显子L858R基因突变和20号外显子T790M基因突变的探针，可能对筛选TKI敏感及耐药的人群提供帮助，这也为同时检测已知微小突变及大片断缺失/重复提供思路。MLPA技术融合了DNA探针杂交和PCR技术的特点，具有快速、敏感、特异、高效和廉价等优点，是检测大片断缺失/重复的新方法，因此MLPA技术在临床上将有更加广阔的应用前景。

［1］Stuppia L，Antonucci I，Palka G，et al.Use of the MLPA assay in the molecular diagnosis of gene copy number alterations in Human Genetic Diseases［J］.Int J Mol Sci，2012，13:3245-3276.

［2］Cho JY，Cho DY，Ahn SH，et al.Large genomic rearrangement of BRCA1 and BRCA2 genes in familial breast cancer patients in Korea［J］.Fam Cancer，2014，13:205-211.

［3］ Schouten JP，Mcelgunn CJ，Waaijer R，et al.Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification［J］.Nucleic Acids Res，2002，30:e57.doi:10.1093/nar/gnf056.

［4］Omrani MD，Azizi F，Rajabibazl M，et al.Can we rely on the multiplex ligation-dependent probe amplification method（MLPA）for prenatal diagnosis?［J］.Iran J Reprod Med，2014，12:263-268.

［5］Maiques O，Cuevas D，Garcia DD，et al.FISH analysis of PTEN in endometrial carcinoma.Comparison with SNP arrays and MLPA［J］.Histopathology，2014，65:371-388.

［6］Bunyan DJ，Eccles DM，Sillibourne J，et al.Dosage analysis of cancer predisposition genes by multiplex ligation-dependent probe amplification［J］.Br J Cancer，2004，91:1155-1159.

［7］ Wang F，Fang Q，Ge Z，et al.Common BRCA1 and BRCA2 mutations in breast cancer families:a meta-analysis from systematic review［J］.Mol Biol Rep，2012，39:2109-2118.

［8］Swensen J，Hoffman M，Skolnick MH，et al.Identification of a 14 kb deletion involving the promoter region of BRCA1 in a breast cancer family［J］.Hum Mol Genet，1997，6:1513-1517.

［9］Hogervorst FB，Nederlof PM，Gille JJ，et al.Large genomic deletions and duplications in the BRCA1 gene identified by a novel quantitative method［J］.Cancer Res，2003，63:1449-1453.

［10］Fachal L，Blanco A，Santamarina M，et al.Large genomic rearrangements of BRCA1 and BRCA2 among patients referred for genetic analysis in Galicia（NW Spain）:Delimitation and mechanism of three novel BRCA1 rearrangements［J］.PLoS One，2014，9:e93306.doi:10.1371/journal.pone.0093306.

［11］Blay P，Santamaria I，Pitiot AS，et al.Mutational analysis of BRCA1 and BRCA2 in hereditary breast and ovarian cancer families from Asturias（Northern Spain）［J］.BMC Cancer，2013，13:1-10.

［12］ Kwong A，Ng EK，Tang EY，et al.A novel de novo BRCA1 mutation in a Chinese woman with early onset breast cancer［J］.Fam Cancer，2011，10:233-237.

［13］Quadri M，Vetro A，Gismondi V，et al.APC rearrangements in familial adenomatous polyposis:heterogeneity of deletion lengths and breakpoint sequences underlies similar phenotypes［J］.Fam Cancer，2015，14:41-49.

［14］Rustgi AK.Familial pancreatic cancer:genetic advances［J］.Genes Dev，2014，28:1-7.

［15］Wijnen J，van der Klift H，Vasen H，et al.MSH2 genomic deletions are a frequent cause of HNPCC［J］.Nat Genet，1998，20:326-328.

［16］De Lellis L，Aceto GM，Curia MC，et al.Integrative analysis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer:the contribution of allele-specific expression and other assays to diagnostic algorithms［J］. PLoSOne，2013，8:e81194.doi:10.1371/journal.pone.0081194.

［17］Neugut AI，Hillyer GC，Kushi LH，et al.Non-initiation and early discontinuation ofadjuvanttrastuzumab in women with localized HER2-positive breast cancer［J］.Breast Cancer，2014，21:780-785.

［18］Sadeghi S，Olevsky O，Hurvitz SA.Profiling and targeting HER2-positive breast cancer using trastuzumab emtansine［J］.Pharmgenomics Pers Med，2014，7:329-338.

［19］Kuijpers CC，Moelans CB，van Slooten HJ，et al.Added value of HER-2 amplification testing by multiplex ligationdependent probe amplification in invasive breast cancer［J］.PLoS One，2013，8:e82018.doi:10.1371/journal.pone.0082018.

［20］ Moelans CB，de Weger RA，van Blokland MT，et al.HER-2/neu amplification testing in breast cancer by multiplex ligation-dependent probe amplification in comparison with immunohistochemistry and in situ hybridization［J］.Cell Oncol，2009，31:1-10.

［21］Weller M，Kaulich K，Hentschel B，et al.Assessment and prognostic significance of the epidermal growth factor receptor vIII mutation in glioblastoma patients treated with concurrent and adjuvant temozolomide radiochemotherapy［J］.Int J Cancer，2013，134:2437-2447.

［22］Faulkner C，Palmer A，Williams H，et al.EGFR and EGFRvIII analysis in glioblastoma as therapeutic biomarkers［J］.Br J Neurosurg，2014，1:1-7.

［23］Jeuken J，Sijben A，Alenda C，et al.Robust detection of EGFR copy number changes and EGFR variant III:technical aspects and relevance for glioma diagnostics［J］.Brain Pathol，2009，19:661-671.

［24］Moelans CB，de Weger RA，Ezendam C，et al.HER-2/neu amplification testing in breast cancer by Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification:influence of manual-and laser microdissection［J］.BMC Cancer，2009，9:1-9.