唐汉庆　郑建宇　窦锡彬　李克明　赵玉峰　李晓华　舒方义　廉春容　杨园园(右江民族医学院，广西　百色　533000)

壮医药线点灸联合针挑疗法对大鼠抗氧化损伤与衰老的影响

唐汉庆郑建宇窦锡彬李克明赵玉峰李晓华舒方义廉春容杨园园
(右江民族医学院，广西百色533000)

〔摘要〕目的探讨壮医药线点灸联合针挑疗法抗氧化损伤与衰老的效果。方法SPF级Wistar大鼠100只随机分为正常对照组(简称对照组)、模型组、药线组、针挑组及药线+针挑组(简称联合组)，每组20只。药线组、针挑组、联合组分别给予药线点灸、针挑和药线点灸、针挑联合应用治疗。对照组、模型组不予特殊处理。连续3个疗程。检测活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)、脑脂褐素(LF)活性或水平变化及形态学观察端粒酶表达。结果与对照组比较，模型组ROS、MDA和LF水平升高或显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，SOD、GSH-Px活性均显著降低(P＜0.01)。与模型组比较，联合组SOD、GSH-Px活性升高最显著(P＜0.01) ; ROS水平、MDA水平和LF水平均下降或显著下降(P＜0.05或P＜0.01)。与对照组比较，模型组端粒酶表达密度减少，表达活性降低。与模型组比较，药线组和针挑组端粒酶表达密度增强，表达活性上升;而联合组端粒酶表达密度显著增强，表达活性显著上升。结论壮医药线点灸联合针挑疗法可增强抗氧化酶活性和端粒酶表达，提高抗氧化能力，可能是其抗衰老的机制之一。

〔关键词〕壮医药线点灸;壮医针挑;抗氧化;抗衰老

第一作者:唐汉庆(1976-)，男，副教授，博士，主要从事民族医药与中西医结合基础研究。

The effects of anti-oxidative damage and anti-aging by treatment of Zhuang medical thread moxibustion combined with Zhuang acupuncture

TANG Han-Qing，ZHENG Jian-Yu，DOU Xi-Bin，et al.
Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China

【Abstract】Objective To investigate the effects of anti-oxidative damage and anti-aging by treatment of Zhuang medical thread moxibustion combined with Zhuang acupuncture．Methods One hundred Wistar mice，SPF grade，were divided randomly into control，model，medical thread，acupuncture，combined groups with twenty mice in each group．Medical thread，acupuncture，combined groups were respectively treated with Zhuang medical thread moxibustion，Zhuang acupuncture and Zhuang medical thread moxibustion combined with Zhuang acupuncture．The levels of ROS，MDA，LF(lipofusin)，activity of SOD，GSH-Px were tested and morphologic changes of telomerase were observed．Results Compared to those of control group，the levels of ROS，MDA，LF were increased in model group (P＜0．05 or P＜0．01)，the activities of SOD，GSH-Px were decreased significantly (P＜0．01)．Compared to those of model group，the activities of SOD and GSH-Px were increased significantly in combined group (P＜0．01) while the levels of ROS，MDA，LF were reduced(P＜0．05 or P＜0．01)．Compared to those of control group，the expression density and activity of telomerase were reduced in model group．Compared to those of model group，the expression density and activity of telomerase were increased in medical thread and acupuncture groups and they were increased obviously in combined group．Conclusions Zhuang medical thread moxibustion combined with Zhuang acupuncture could enhance activity of antioxidant enzyme and expression of telomerase and improve ability of antioxidation，which might be one of anti-aging mechanisms．

【Key words】Zhuang medical thread moxibustion; Zhuang acupuncture; Antioxidation; Anti-aging

壮医药线点灸和针挑疗法均是壮医的特色医技疗法。药线点灸疗法已经被实践证明对慢性疼痛、老年病、失眠、哮喘、风湿病等许多慢性病、疑难杂症有良好的疗效，具有科学性、创新性、实用性〔1〕。壮医针挑疗法也是壮医的特色医技疗法，对哮喘、失眠、腰痛、甲亢、皮肤病、风湿痛等适宜病症疗效较好，也有不少的报道〔2〕。对这两种技法的临床治疗报道较多，近来对两种技法在延缓衰老、养生保健方面的研究也引起重视，研究表明抗衰老和抗氧化作用是相互联系的，与体内自由基增多及端粒酶表达的变化有关〔3，4〕。本研究观察壮医药线点灸和针挑疗法对衰老大鼠的抗氧化和抗衰老作用并讨论其可能机制。

1　材料与方法

1.1实验动物与分组SPF级Wistar大鼠100只，雌雄各半，体质量(173.18±7.65) g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号: SCXK(京) 2013-0004。动物在安静环境下分笼饲养，室温控制在(23±1)℃范围内，相对湿度65％～70％，大鼠以基础饲料常规饲养，自由饮水，大鼠适应性饲养3 d后，随机数字表法分为5组:正常对照组(简称对照组)、模型组、药线组、针挑组及药线+针挑组(简称联合组)。每组20只。所有实验大鼠的使用和喂养遵照《关于善待实验动物的指导性意见》(2006)相关条款。

1.2主要试剂和仪器D-半乳糖(北京化学试剂公司，批号: 20110625)、超氧化物歧化酶(SOD，批号2013X0115)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px，批号20130206)、丙二醛(MDA，批号201302032)、活性氧(ROS，批号201306002)、脑脂褐素(LF，批号20131003)检测试剂盒(武汉博士德公司提供) ;兔抗端粒酶多克隆抗体(Sigma，USA)、羊抗兔IgG及DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)。

台式高速低温离心机(Z360K型，德国HERMLE公司)、电子天平(AE160型，瑞士Mettler公司)、分光光度计(722型，上海精密科学仪器有限公司)、荧光分光光度计(F-3000型，日本日立)、电动玻璃匀浆机(DY-89型，宁波新芝公司)、酶标仪(MK3型，Thermo Labsystem公司)、电脑快速恒冷冷冻石蜡两用切片机(KD-2258-VI，浙江科迪)、荧光显微镜(Olympus IX51，日本)和倒置式生物显微镜(DMIL LED，德国莱卡)。

1.3造模方法及分组处理采用D-半乳糖腹腔注射造模，造模后分为模型组、药线组、针挑组采用联合组，余下为对照组。

药线组:取双侧足三里穴位(ST36)，拇指和食指手持中号壮医药线(药线直径为0.7 mm)在酒精灯或蜡烛上点燃后，熄灭药线明火火焰，此时药线剩下圆珠状炭火星，顺应手腕和拇指的屈曲动作，拇指指腹稳重而敏捷地将有圆珠状炭火星线头直接点压于足三里穴位上，火灭即起称为1壮，每穴每次共灸3壮。每天每穴点灸1次。7 d为1个疗程，间隔1 d继续下个疗程。

针挑组:取双侧阳陵泉(GB34)、环跳(GB30)穴位。穴位皮肤常规消毒，采用消毒大号缝衣针将上述穴位作为针挑点，用拇指、食指、中指合拢把针握紧，挑出皮下一些白色纤维组织，然后用针在该穴位垂直快速点刺3次，刺入皮下1 mm，点刺后以5％碘酒、75％酒精消毒，每天每穴位挑刺1次。7 d为1个疗程，间隔1天继续下个疗程。

联合组:联合采用上述药线组和针刺组的操作方法。药线组、针挑组、联合组均进行连续3个疗程的处理。模型组和对照组不作特殊处理。

1.4指标检测疗程结束后处死大鼠。取静脉血2 ml，离心(4℃，1 000 r/min，10 min)，分离血清，－70℃冻存。采用比色法测定血清ROS活性，二硫代二硝基苯甲酸法测定GSH -Px活性，黄嘌呤氧化酶法测定血清SOD活性;硫代巴比妥酸法测定MDA含量。另取大鼠脑组织液氮中冻存，检测前用生理盐水制备成10％匀浆，离心(4℃，3 000 r/min，15 min)，取上清荧光法测定LF含量。均严格按说明书操作进行检测。

1.5端粒酶表达形态观察免疫组化法检测，大鼠脑组织置于电脑快速恒冷冷冻石蜡两用切片机，进行连续切片，片厚10 μm，PBS泡洗30 min，干燥后进行端粒酶免疫组化染片，加入兔抗端粒酶多克隆抗体室温避光孵育10 h，洗去一抗，加FITC标记羊抗兔IgG孵育3 h，洗去二抗，DAB显色试剂盒显色，干燥，封片，显微镜下观察并拍摄。

1.6统计学处理采用SPSS13.0软件。计量资料采用单因素方差分析，样本均数间的两两比较用LSD检验方法。

2　结果

2.1SOD活性检测结果与对照组〔(193.28±16.78) U/ml〕比较，模型组SOD活性〔(90.14±6.88) U/ml〕显著下降(P＜0.01)。与模型组比较，药线组〔(141.21±10.02) U/ml〕和针挑组〔(156.78±12.84) U/ml〕SOD活性上升(P＜0.05) ;而联合组SOD活性〔(189.98±18.26) U/ml〕显著上升，接近对照组水平，与模型组比较差异显著(P＜0.01)。

2.2GSH-Px活性检测结果与对照组〔(104.28± 8.83) U/ml〕比较，模型组〔(30.29±3.84) U/ml〕GSH-Px活性显著下降(P＜0.01)。与模型组比较，药线组〔(52.31± 4.12) U/ml〕GSH-Px活性有升高，但无统计学差异(P＞0.05) ;与模型组比较，针挑组GSH-Px活性〔(82.33±5.02) U/ml〕上升(P＜0.05) ;而联合组GSH-Px活性〔(95.29±8.39) U/ml〕显著上升，趋近对照组水平，与模型组比较差异显著(P＜0.01)。

2.3端粒酶表达形态观察与对照组比较，模型组端粒酶表达密度减少，表达活性降低。与模型组比较，药线组和针挑组端粒酶表达密度增强，表达活性上升;而联合组端粒酶表达密度显著增强，表达活性显著上升，见图1。

图1　各组端粒酶表达形态比较(IHC，×40)

2.4ROS、MDA和LF检测结果与对照组比较，模型组ROS、MDA和LF水平升高或显著升高(P＜0.05或P＜0.01) ;与模型组比较，药线组ROS、MDA和LF水平有下降趋势，但无统计学差异(P＞0.05) ;针挑组ROS、MDA和LF水平下降(P＜0.05) ;联合组ROS、MDA和LF水平下降或显著下降(P＜0.05或P＜0.01)，见表1。

表1　各组ROS、MDA和LF水平比较(±s)

表1　各组ROS、MDA和LF水平比较(±s)

与对照组比较: 1) P＜0.05，2) P＜0.01;与模型组比较: 3) P＜0.05，4) P＜0.01

组别　n　 ROS(ng/L)　 MDA(mol/L)　 LF(μg/g)对照组　20　 23.56±6.01　 5.78±1.46　 54.24±7.45模型组　20　 56.34±8.962)　21.45±2.162)　70.01±8.091)药线组　20　 32.22±5.23　 16.02±1.74　 63.29±8.55针挑组　20　 29.24±5.863)　7.98±1.873)　53.02±7.853)联合组　20　 21.04±5.164)　5.64±1.154)　51.22±7.813)

3　讨论

D-半乳糖经过半乳糖氧化酶催化生成醛糖和过氧化氢，使机体产生过量的ROS和超氧自由基，超氧自由基具有显著增强机体内脂质过氧化反应的作用〔5〕，而脂质过氧化反应的主要产物MDA通过交联蛋白和DNA诱导LF的大量生成，反过来又加重过氧化损伤〔6，7〕，氧化损伤可导致机体细胞功能损害及抗氧化酶如SOD、GSH-Px活性降低，是衰老发生的重要原因。因此，抗氧化与抗衰老是密切相关的，许多延缓衰老的保健方法或保健食品都具有不同程度的抗氧化作用。SOD、GSH-Px活性以及ROS、LF、MDA水平可以反映机体脂质过氧化的程度及机体清除自由基的能力，是抗氧化和抗衰老研究中常用到的指标。SOD和GSH-Px是机体的抗氧化酶，SOD能特异清除体内氧自由基，把氧自由基歧化生成过氧化氢〔12〕，然后通过GSH-Px将过氧化氢转化为水发挥抗氧化作用，通过检测SOD和GSH -Px活性可以推知机体抗氧化能力。

研究表明〔8，9〕，针刺和点灸环跳穴、足三里等能提高SOD含量、降低MDA水平，提示针刺和点灸环跳穴、足三里等穴位具有抗氧化损伤的作用。另外有研究显示〔10，11〕，针刺阳陵泉能提高SOD活性，减轻缺血再灌注和MPTP诱导帕金森大鼠模型新纹状体的氧化损伤。因此，针刺和点灸环跳穴、足三里、阳陵泉等具有潜在的抗氧化、抗衰老作用〔12〕。本实验也表明D-半乳糖注射造模已引起模型动物体内氧化损伤，这是衰老发生的重要环节，采用壮医药线点灸和针挑疗法干预后，ROS、MDA和LF水平均有不同程度的下降，而SOD和GSH-Px活性均有不同程度的升高，以联合组的表现最明显。提示壮医药线点灸和针挑疗法可从提高抗氧化能力、减少氧化产物生成以及增强抗氧化酶活性方面发挥抗衰老作用。

氧化损伤可引起机体细胞功能损害，导致细胞凋亡，从而表现出衰老的特征。近来研究〔13〕显示端粒酶使细胞寿命延长，端粒酶活性表达高低能够反映机体抗衰老能力的高低〔14〕。本实验结果提示药线点灸和针挑联用可以增强端粒酶活性而发挥抗衰老作用。

壮医药线点灸疗法是广西壮族地区群众常用的特色疗法，壮医药理论和实践已证明其具有温经通络止痛的效果，通过疏通“龙路”、“火路”，通行血脉、祛邪外出，达到“天地人”三气同步、气血平衡的健康状态，对慢性疼痛、风湿痹痛等慢性病疗效确切。针挑疗法同作为壮医特色疗法，壮医专家黄汉儒〔15〕认为针挑疗法的作用机制是挑刺可以激发人体正气，将郁滞体内的有形或无形之毒从体表针挑点驱出，体现壮医理论“调气、祛毒”的治疗原则。本实验探讨药线点灸和针挑疗法抗氧化、抗衰老的机制，观察其作为养生保健方法的可能性，为将其作为新的疗养手段提供依据。

4　参考文献

1滕红丽.壮医药线点灸疗法概论〔J〕．辽宁中医药大学学报，2010; 12 (1) : 21-2．

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15黄汉儒.壮医理论体系概述〔J〕．中国中医基础医学杂志，1996; 6 (11) : 3-7．

〔2014-09-17修回〕

(编辑李相军)

通讯作者:郑建宇(1958-)，女，教授，主任医师，主要从事针灸临床与基础研究。

基金项目:国家自然科学基金项目(No．81360579)

〔中图分类号〕R244.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 16-4429-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.005