丛林 夏志宽 李海涛 杨蓉娅（北京军区总医院全军皮肤损伤修复研究所，北京100700）

RAW264．7小鼠巨噬细胞与阿萨希毛孢子菌相互作用后TNF⁃α、IL⁃1β和CCL3的表达变化

丛林 夏志宽 李海涛 杨蓉娅
（北京军区总医院全军皮肤损伤修复研究所，北京100700）

【摘要】目的 研究RAW264．7小鼠巨噬细胞与T．asahii相互作用后TNF⁃α，IL⁃1β和CCL3的表达水平变化。方法RAW264．7细胞与T．asahii菌液共孵育3 h、6 h、9 h、12 h，对照组不加菌液。在各孵育时间点取上清液，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测上清液中TNF⁃α、IL⁃1β和CCL3的含量。台盼蓝拒染法计各孵育时间点RAW264．7细胞的活细胞数。结果 RAW264．7细胞与T．asahii共孵育3 h、6 h、9 h、12 h后，TNF⁃α、IL⁃1β、CCL3的表达水平均明显高于对照组，有显著性差异（P＜0．05）。3种细胞因子的表达水平随共孵育时间延长而增高，共孵育9 h的表达水平最高。RAW264．7细胞的活细胞数随共孵育时间延长而逐渐下降，共孵育12 h后的活细胞数量与其他各时间点有统计学差异（P＜0．05）。结论 RAW264．7小鼠巨噬细胞面临T．asahii感染时可分泌TNF⁃α、IL⁃1β、CCL3等细胞因子，这些炎性细胞因子可能参与了抗T．asahii感染的免疫反应。

【关键词】巨噬细胞；阿萨希毛孢子菌；细胞因子

［Chin J Mycol，2015，10（4）：203⁃206］

阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T．asa⁃hii）是播散性毛孢子菌病的主要病原菌，可导致系统性、播散性感染。2001年杨蓉娅等［1］报道了国内首例播散性毛孢子菌病。播散性阿萨希感染主要见于免疫缺陷宿主，致死率高，近10 a其发病率呈逐渐上升趋势［2］，但是关于T．asahii的感染机制及宿主的防御机制目前研究较少。

我们前期应用全基因组芯片研究了人THP⁃1单核细胞与T．asahii体外作用的早期转录谱变化。结果显示，THP⁃1细胞与T．asahii体外作用3 h后，有大量基因表达上调，上调的基因主要涉及固有免疫、炎症反应、信号转导、抗凋亡等生物学过程［3］。这说明固有免疫细胞在遭遇阿萨希毛孢子菌感染时可启动固有免疫系统发挥抗感染作用。

为进一步研究宿主免疫细胞在抗T．asahii感染中的作用，我们研究了RAW264．7小鼠巨噬细胞与T．asahii相互作用后炎性细胞因子的表达变化，现报告如下。

1　材料与方法

1．1材料

细胞 RAW264．7小鼠巨噬细胞株购买自中国协和医科大学基础医学院细胞中心。

菌株 T．asahii菌株购买自荷兰真菌菌种保藏中心保存的T．asahii标准株（编号CBS2479）。经API20C系统生化鉴定及DNA序列分析验证（AS2．2174）。

主要试剂 胎牛血清（FBS，美国Hyclone公司）、DMEM高糖液体培养基（美国Hyclone公司）、磷酸盐缓冲液（PBS，美国Hyclone公司）、细胞消化液（0．25%胰蛋白酶⁃EDTA，碧云天生物技术有限公司）、DMEM高糖培养基（美国Hyclone公司）、链霉素100 μg／mL和青霉素100 μg／mL（碧云天生物技术有限公司）。台盼蓝染料（美国sigma公司）。

1．2方法

T．asahii的传代、培养 将⁃80℃保存的T．asa⁃hii标准株接种于沙式琼脂培养基，复苏活化后转种于YPD液体培养基中，30℃、150 r／min摇床培养12 h，使其形成含95%孢子（包括芽生孢子和关节孢子）的菌悬液，6 000 r／min离心5 min收集孢子，PBS洗涤3次，剧烈振荡使之形成单个孢子悬液，调整细胞数到1×106个／mL。

RAW264．7细胞的传代、培养 RAW264．7细胞用含10%FBS的DMEM高糖培养基，在37℃，5%CO2培养箱中培养、传代。取对数生长期的细胞，用0．25%胰酶⁃EDTA消化，制备分散均匀的单细胞悬液，台盼蓝拒染法计活细胞数＞95%，调整细胞浓度至1×105个／mL。

共培养体系 将1×105个／mL的RAW264．7细胞接种于96孔板，每孔100 μL。实验组加入100 μL浓度为1×106个／mL的T．asahii菌液（细胞∶菌＝1∶10），37℃，5%CO2共孵育3 h、6 h、9 h、12 h。对照组不加菌液，继续培养3 h、6 h、9 h、12 h。在各孵育时间点取上清液，转移到另一96孔板，置于⁃80℃冰箱待检。用DMEM液体培养基清洗2遍去除残留的菌液，台盼蓝拒染法计RAW264．7细胞的活细胞数，至少计数100个细胞。

上清液中细胞因子的检测 采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA），严格按照ELISA试剂盒（美国R＆D公司）说明书操作，首先用标准品绘制出标准曲线，得出线性回归方程，再将各组所测出的A值带入方程中，计算出样品中TNF⁃α、IL⁃1β、CCL3的含量，每样品均设2个复孔，实验共重复3次，检测结果以pg／mL表示。

1．3统计学方法

采用SPSS 18．0软件进行统计学分析，ELISA结果以（xୱ±s）表示，用重复测量方差分析（ANO⁃VA）进行各组均数的两两比较。RAW264．7活细胞计数用（xୱ±s）表示，用t检验进行统计学分析。

2　结 果

RAW264．7细胞与T．asahii共孵育3 h、6 h、9 h、12 h后，TNF⁃α、IL⁃1β、CCL3的表达水平均明显高于对照组，有显著性差异（P＜0．05）（见图1 ～3）。

TNF⁃α、IL⁃1β、CCL3的表达水平随共孵育时间延长而增高。共孵育9 h后3种细胞因子的表达水平最高，共孵育12 h后3种细胞因子的表达水平较共孵育9 h有所降低，但无统计学差异（P＞0．05），即3种细胞因子在各时间点的表达水平进行两两比较，除9 h与12 h无统计学差异外，均有显著性差异（P＜0．05）。RAW264．7细胞与T．asahii共孵育3 h、6 h、9 h、12 h，相同时间点，实验组TNF⁃α、IL⁃1β、CCL3的表达水平均明显高于对照组，差异有统计学差异（P＜0．05），见表1。

RAW264．7细胞与T．asahii共孵育3 h、6 h、9 h、12 h后应用台盼蓝拒染法检测活细胞的数量。结果显示，RAW264．7细胞的活细胞数随共孵育时间延长而下降，共孵育12 h后的活细胞数量与其他各时间点有统计学差异（P＜0．05），实验组其余各时间点及对照组各时间点之间比较无统计学差异（P＞0．05），见表2。

3　讨 论

T．asahii进入宿主体内后是否致病，是由宿主的免疫防御状态和菌株致病力两个因素决定的。国际上报道由T．asahii所致的播散性毛孢子菌病大多数发生于恶性血液病等免疫功能缺陷人群中［4］。可见，研究宿主对阿萨希毛孢子菌的免疫防御机制对于探求播散性毛孢子菌病发病机制非常重要。

图1　RAW264．7细胞∗与T．asahii共孵育3 h、6 h、9 h、12 h后，TNF⁃α的表达水平均明显高于对照组，有统计学差异（P＜0．05） 图2 RAW264．7细胞∗与T．asahii共孵育3 h、6 h、9 h、12 h后，IL⁃1β的表达水平均明显高于对照组，有统计学差异（P＜0．05） 图3 RAW264．7细胞∗与T．asahii共孵育3 h、6 h、9 h、12 h后，CCL3的表达水平均明显高于对照组，有统计学差异（P＜0．05）Fig．1 The level of TNF⁃α in the supernatant released by RAW264．7 cells after incubation with T．asahii for 3，6，9，or 12 h was significantly higher than those in control group（P＜0．05） Fig．2 The levels of IL⁃1β in the supernatant released by RAW264．7 cells after incubation with T．asahii for 3，6，9，or 12 h was significantly higher than those in control group（P＜0．05） Fig．3 The levels of CCL3 in the supernatant released by RAW264．7 cells after incubation with T．asahii for 3，6，9，or 12 h was significantly higher than those in control group（P＜0．05）

表1　RAW264．7细胞与T．asahii共孵育后上清液中TNF⁃α、IL⁃1β、CCL3的表达水平Tab．1 The levels of TNF⁃α，IL⁃1β and CCL3 in the supernatants released by RAW264．7 cells after incubation with T．asahii

表2　RAW264．7细胞与T．asahii共孵育后活细胞的数量Tab．2 Viable count of RAW264．7 macrophages incubated with T．asahii

巨噬细胞是重要的固有免疫细胞，在抗感染免疫中发挥重要作用。它通过调理素（特异性抗体、补体、甘露聚糖结合蛋白）和非调理素（甘露聚糖受体、葡聚糖受体等）依赖的机制吞噬病原体，并产生多种效应分子杀伤病原体，而细胞因子在抗真菌感染的过程中，起着重要的免疫调节作用［5］。

TNF⁃α、IL⁃1β是宿主抗真菌免疫防御的重要细胞因子。TNF⁃α可增强巨噬细胞吞噬、杀伤病原真菌的功能［6］。TNF⁃α和IL⁃1β还可以诱导其他炎性细胞因子的分泌，发挥保护性免疫防御功能［7⁃8］。CCL3又叫巨噬细胞炎性蛋白1⁃α（MIP⁃1α），是一种重要的趋化因子，它可以募集炎性细胞到感染部位，通过炎性细胞及其分泌的细胞因子发挥抗感染作用。CCL3已被证实在中性粒细胞减少的宿主免疫细胞对抗侵袭性肺曲霉病发挥重要作用［9］。

本课题组前期报道了人THP⁃1单核细胞对T．asahii感染的早期转录谱反应，人THP⁃1细胞与T．asahii相互作用3 h后，有463个基因表达明显上调；生物信息学分析提示表达上调基因主要涉及固有免疫、炎症反应、信号转导、抗凋亡等生物学过程，其中上调幅度最大的主要是TNF⁃α等炎性细胞因子［2］。

研究表明，不同的病原真菌对固有免疫细胞分泌细胞因子的影响不同。蒋丽等［10］研究了Fonse⁃caea monophora对巨噬细胞TLR2、TLR4、Dectin⁃1 和TNF⁃α表达的影响。结果显示，F．monophora分生孢子突变株（色素株，CBSl22845）可以通过抑制TNF⁃α分泌来抑制炎症反应，维持菌体在巨噬细胞中的长期生存和繁殖。而我们的实验结果与前期的转录谱研究一致，并在不同种属中证实了宿主单核／巨噬细胞面临T．asahii感染时可分泌TNF⁃α、IL⁃1β、CCL3等细胞因子，形成强大的炎症反应，从而发挥抗真菌感染的免疫防御作用，也说明T．asa⁃hii对宿主免疫细胞分泌炎性细胞因子可能没有抑制作用。此实验结果与T．asahii所致播散性毛孢子菌病临床罕见的情况相符。实际上，在免疫正常人群中，宿主的固有免疫细胞可通过其吞噬、杀伤功能及分泌细胞因子等炎性介质，发挥清除病原真菌的作用，这也许正是播散性毛孢子菌病发病率很低的原因。

在本实验采用的细胞／菌比例下，RAW264．7细胞的活细胞数随共孵育时间延长而下降，提示T．asahii大量繁殖时对RAW264．7细胞的活力有一定影响。而TNF⁃α、IL⁃1β、CCL3的表达水平在共孵育12 h后较共孵育9 h有所下降，我们推测，这可能与RAW264．7细胞的活细胞数量在共孵育12 h后明显下降导致细胞因子分泌减少有关，而分泌在上清液中的细胞因子也可能随时间延长而部分失活。

研究宿主和病原真菌的相互作用，可加深对病原真菌感染的致病机制及宿主防御机制的理解，而宿主与病原真菌的相互作用复杂。本实验仅为小鼠巨噬细胞与T．asahii相互作用的初步研究，宿主固有免疫细胞在抵抗T．asahii感染中的免疫防御机制尚需进一步实验研究。

参考文献

［1］ 杨蓉娅，敖俊红，王文岭，等．阿萨希丝孢酵母引起播散性毛孢子菌病国内首例报告［J］．中华皮肤科杂志，2001，34（5）：329⁃332．

［2］ Vazquez JA．Trichosporon infection［J］．Curr Fungal Infect Rep，2010，4（1）：52⁃58．

［3］ Cong L，Liao Y，Lu X，et al．Early transcriptional response of hu⁃man monocyte⁃like THP⁃1 cells in response to Trichosporon asa⁃hii infection［J］．Mycopathologia，2014 Sep 2．［Epub ahead of print］

［4］ 丛林，李海涛，王文岭，等．侵袭性毛孢子菌感染的诊断和治疗［J］．中国真菌学杂志，2010，5（3）：184⁃187．

［5］ 聂建巍，杨蓉娅，丛林，等．干扰素γ增强RAW264．7巨噬细胞对阿萨希毛孢子菌杀伤作用的机制研究［J］．实用皮肤病学杂志，2012，5（1）：5⁃8．

［6］ Kawakami K，Qureshi MH，Koguchi Y，et al．Role of TNF⁃alpha in the induction of fungicidal activity of mouse peritoneal exudate cells against Cryptococcus neoformans by IL⁃12 and IL⁃18［J］．Cell Immunol，1999，193（1）：9⁃16．

［7］ Vonk AG1，Netea MG，van Krieken JH，et al．Endogenous inter⁃leukin（IL）⁃1 alpha and IL⁃1 beta are crucial for host defense a⁃gainst disseminated candidiasis［J］．J Infect Dis，2006，193 （10）：1419⁃1426．

［8］ Netea MG，Stuyt RJ，Kim SH，et al．The role of endogenous inter⁃leukin（IL）⁃18，IL⁃12，IL⁃1 beta，and tumor necrosis factor⁃al⁃pha in the production of interferon⁃gamma induced by Candida albicans in human whole⁃blood cultures［J］．J Infect Dis，2002，185（7）：963⁃970．

［9］ Mehrad B，Moore TA，Standiford TJ．Macrophage inflammatory protein⁃1 alpha is a critical mediator of host defense against inva⁃sive pulmonary aspergillosis in neutropenic hosts［J］．J Immunol，2000，165（2）：962⁃968．

［10］ 蒋丽，张军民，孙九峰，等．Fonsecaea monophora对巨噬细胞TLR2、TLR4、Dectin⁃1和TNF⁃α表达的影响［J］．中国真菌学杂志，2014，9（3）：134⁃138．

［本文编辑］ 王 飞

·论著·

Expression of TNF⁃α，IL⁃1β and CCL3 in RAW264．7 macrophages challenged with Trichosporon asahii

CONG Lin，XIA Zhi⁃kuan，LI Hai⁃tao，YANG Rong⁃ya
（Department of Dermatology，General Hospital of Beijing Military Command，Beijing 100700，China）

【Abstract】Objective To explore the protein levels of TNF⁃α，IL⁃1β and CCL3 in RAW264．7 macrophages challenged with Tri⁃chosporon asahii（T．asahii）．Methods RAW264．7 macrophages were incubated with T．asahii or medium alone（control group）for 3，6，9，or 12 h，then the cytokine concentrations（TNF⁃α，IL⁃1β and CCL3）in the supernatants were determined using commercial ELISA kits．The numbers of viable RAW264．7 macrophages after incubated with T．asahii for 3，6，9，or 12 h were counted by using trypan blue staining method．Results The protein levels of TNF⁃α，IL⁃1β and CCL3 in the supernatants when RAW264．7 macropha⁃ges incubated with T．asahii for 3，6，9，or 12 h were significantly higher than those in control group（P＜0．05）．The protein levels of these 3 cytokines were gradually elevated with the extension of incubation time and peaking at 9 h．The numbers of viable RAW264．7 macrophages were gradually declined with the extension of incubation time．The numbers of viable RAW264．7 macrophages were significantly declined after incubated with T．asahii for 12 h（P＜0．05）．Conclusion RAW264．7 macrophages could secrete TNF⁃α，IL⁃1β and CCL3 when challenged with T．asahii and these inflammatory cytokines may be involved in the anti⁃fungal immune response of RAW264．7 macrophages against T．asahii infection．

【Key words】macrophages；Trichosporon asahii；cytokines

［收稿日期］2014⁃11⁃30

通讯作者：杨蓉娅，E⁃mail：yangrya＠sina．com

作者简介：丛林，男（汉族），博士，主治医师．E⁃mail：conglin369＠163．com

基金项目：国家自然科学基金（81271764，81472892）

【中图分类号】R 379．9

【文献标识码】A

【文章编号】1673⁃3827（2015）10⁃0203⁃04