安蓬蓬，汤 华，郭军飞

（1.天津市血液中心质管科，天津300110；2.天津医科大学天津市生命科学中心实验室，天津300070）

论著

血浆miRNA-372/373在正常献血者和HBV早期感染献血者中的表达差异

安蓬蓬1，汤 华2，郭军飞2

（1.天津市血液中心质管科，天津300110；2.天津医科大学天津市生命科学中心实验室，天津300070）

目的：研究miRNA-372/373与HBV早期感染的相关性，分析其在HBV早期感染诊断中的潜在应用价值。方法：收集来源于2013年3月至9月天津市内无偿献血者所献血液的血浆标本留样，共54份，分为正常组、酶免单阳组（E单阳组）和酶免核酸双阳组（EN双阳组）。提取此3组共54份血浆标本中的miRNA－372和miRNA－373，用实时荧光定量PCR方法进行检测。分别比较miRNA－372和miRNA－373在3组血浆标本之间的表达差异，并对各组间的miRNA表达趋势进行统计学分析；同时，对miRNA－372、miRNA－373的相对表达水平分别与核酸检测HBV核酸阳性血浆标本中的HBV DNA拷贝数进行相关性分析。结果：经实时荧光定量PCR检测，与正常献血者相比，miRNA－372、miRNA－373在E单阳组和EN双阳组中均表达上调，其中，miRNA－372、miRNA－373在EN双阳组中表达上调更为显著。进一步分析发现，在EN双阳组中，miRNA－372、miRNA－373均与相应的HBV DNA拷贝数呈正相关性，且与miRNA－372相比，miRNA－373与相应的HBV DNA拷贝数的正相关性更为明显。结论：miRNA－372、miRNA－373与HBV早期感染密切相关，提示miRNA－372、miRNA－373在HBV感染的早期诊断中具有潜在价值。

微小RNA；miRNA-372；miRNA-373；HBV早期感染

在我国，乙肝病毒是威胁血液安全的主要因素。目前，采供血机构多同时采用ELISA检测和核酸检测（NAT）两种方法对血液进行HBV检测。虽然NAT检测大大缩短了HBV的检测“窗口期”，很大程度上降低了经血传播疾病发生的风险，但NAT检测的准确性还是会受到病毒含量、病毒变异等因素的影响。1993年，Lee等[1]发现了第一个miRNA（lin-4），它是一类长度在21～25 nt的内源性非编码单链小分子RNA。2008年，Lawrie首次在人类血清中发现miRNA，由于miRNA可以广泛而稳定地存在于人类细胞外液，一直以来，科学家都致力于其在非侵袭性临床疾病诊断中的应用。miRNA-373与miRNA-371a、miRNA-371b及miRNA-372同属于miRNA-371-373簇[2]，它们源自相同的初级miRNA的转录[3]，对HBV感染来说，有研究表明miRNA-372/373可以增加HBV蛋白及核心DNA的表达[4]。目前相关研究都是集中在细胞、组织中的miRNA-372/373上，关于循环中、血浆中miRNA-372/373的研究甚少，本研究通过检测HBV感染早期的无偿献血者血浆中和正常献血者血浆中的miRNA（miRNA-372/373）表达差异，进而分析这两种miRNA与HBV早期感染的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 血浆标本来源于2013年3月-9月天津市内无偿献血者所献血液的标本留样，共54份，每份血浆标本量为5 mL，54位无偿献血者均符合《献血者健康检查要求》，年龄18～55岁，为随机抽取。

1.2 试剂与仪器 miRcute miRNA提取试剂盒（北京 TIANGEN），CyDyeTM荧光染料（Amersham Biosciences CyDye），rTaq PCR试剂盒、dNTP（10 mmol/L）、碱性磷酸酶、SYBR Premix EX Taq定量PCR试剂盒（日本TaKaRa），焦碳酸二乙酯DEPC（北京鼎国），RNA酶抑制剂、T4 RNA连接酶、T4多核苷酸激酶、Taq DNA聚合酶（深圳Fermentas），MMLV反转录酶（美国Promega），40%PAGE（丙烯酰胺单体：N’N’亚甲双丙烯酰胺=19：1）（Genview美国），RNase-free水，氯仿，异丙醇，75%乙醇（RNasefree水配制），20×SSC,10×PBS,3 mmol/L氯化钠，0.3 mmol/L柠檬酸钠，10%SDS，5 mmol/L醋酸铵，0.5 mmol/L EDTA,1 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）。所有试剂均在有效期内。Version3.0.0.0016(美国PerkinElmer)，超净工作台（BCM-8）（苏州净化设备公司），iQ5定量PCR检测仪（美国Bio-Rad），紫外分光光度计（美国Bio-tek），台式离心机（德国Eppendorf），miniCyclerTMPCR仪（美国MJ Reasearch）。

1.3 方法

1.3.1 分组方法 所抽取的无偿献血者血浆标本均经过ELISA检测及核酸检测，分别为第1组（正常组）：ELISA检测HBsAg及核酸检测HBV核酸均为阴性的正常的血浆标本18份；第2组（E单阳组）：仅ELISA检测HBsAg阳性而核酸检测HBV核酸阴性的血浆标本18份；第3组（EN双阳组）：ELISA检测HBsAg及核酸检测HBV核酸均阳性的血浆标本18份。其中，以上3种血浆标本的其他血液中心常规检测项目均为阴性，ALT水平正常。追查后两组36份血浆标本的相应献血者，均为无明显症状的轻度早期感染者。ELISA检测由Star全自动加样仪、FAMI24/30全自动酶免分析仪、anthos 340r酶标仪共同完成；ALT检测由TBA-120 FR全自动生化仪完成；核酸检测由Procleix®TRGRIS®核酸检测分析系统和罗氏cobas s201核酸检测系统检测并提供数据。

1.3.2 制备方法 （1）血浆miRNA提取：采用miRcute miRNA提取试剂盒（离心柱型）（北京TIANGEN公司）提取miRNA。（2）miRNA鉴定：采用紫外分光光度法测定miRNA在260 nm和280 nm的吸光度，计算miRNA含量（260 nm的OD=1相当于miRNA含量33 μg/mL），判断提取的miRNA质量（miRNA OD260/OD280应在1.8至2.1之间，OD260/ OD230应大于2.0）。

1.3.3 实时荧光定量PCR方法 miRNA的定量分析采用基于茎-环引物的实时定量PCR方法[5]。

1.3.3.1 RT制备cDNA：RT引物序列见表1。应用hsa-miRNA-16作为内参照。配制反应体系，总体积为13 μL，其中含小片段RNA 2 μL；miRNA-372，miRNA-373，miRNA-16 1 μL；DEPC水10 μL。65℃变性10min，25℃5min，水浴2～5min。补加以下试剂，总体积为20 μL，其中含5×first stand buffer 4 μL；dNTPs（10 mmol/L）1 μL；RNA酶抑制剂（40 U/μL）1 μL；M-MLV（200 U/μL）1 μL。42℃延伸30 min。70℃灭活10 min。产物保存于-20℃。

1.3.3.2 实时定量PCR确定miRNA-372、miRNA-373的相对表达水平：引物序列见表1。反应体系总体积为20 μL。其中含2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL；PCR Forward Primer（5 pmol/μL）1 μL；PCR Reverse Primer（5 pmol/μL）1 μL；模板（RT产物cDNA）2 μL；DDW6μL。循环体系为：95℃预变性3min；95℃30s，56℃30 s，72℃30 s，40个循环。收集结果，按照以下方法进行数据分析。目的miRNA的定量采用相对法，将2-ΔCt作为目的miRNA在样品中的相对含量，其中ΔCt=CtmiRNA-CtmiRNA-16。

1.4 统计学分析 所有计量资料按照均数±标准差的方法进行统计。两组间的比较应用两独立样本t检验。3组及以上间的比较应用单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），组间的进一步两两比较应用SNK-q检验。两组变量的相关性分析应用Pearson相关系数法。检验统计量P＜0.05时具有统计学差异。

表1 RT引物信息表Tab 1 The information table of RT primers

2 结果

2.1 miRNA-372在3组无偿献血者血浆中的相对表达水平差异 相比较于正常组，miRNA-372在E单阳组、EN双阳组无偿献血者血浆中的相对表达水平均明显上调；其中，miRNA-372在EN双阳组中的相对表达水平比在E单阳组上调更为明显（图1）。

图1 miRNA-372在3组无偿献血者血浆中的相对表达水平差异Fig 1 The differential expressions of miRNA-372 in the plasma of the three groups

2.2 miRNA-373在3组无偿献血者血浆中的相对表达水平差异 相比较于正常组，miRNA-373在E单阳组、EN双阳组无偿献血者血浆中的相对表达水平均明显上调；其中，miRNA-373在EN双阳组中的相对表达水平比在E单阳组上调更为明显（图2）。

图2 miRNA-373在3组无偿献血者血浆中的相对表达水平差异Fig 2 The differential expressions of miRNA-373 in the plasma of the three groups

2.3 miRNA-372在EN双阳组与相应的HBV DNA拷贝数的相关性 miRNA-372的相对表达水平随HBV DNA的拷贝数增加而增加，与相应的HBV DNA拷贝数呈正相关性（图3）。

图3 miRNA-372与HBV DNA拷贝数的相关性Fig 3 The correlation between the miRNA-372 and the copy number of HBV DNA

3 讨论

图4 miRNA-373与HBV DNA拷贝数的相关性Fig 4 The correlation between the miRNA-373 and the copy number of HBV DNA

3.1 近年来，miRNA-371-373簇的调节功能引起了人们的关注，但其作用机制还有待深入研究，相关工作还有待继续开展。曾洋等[6]报道，miR-373参与调控Flk1+MSC向骨细胞分化；武卫华等[7]也证实，人工构建的has-miRNA-373载体经转染后可增加肿瘤细胞中E-钙黏蛋白的表达量；同时，刘琳等[8]的研究发现，miRNA-373在宫颈癌组织和Hela细胞中低表达，又起到了抑癌基因的作用。在HBV感染的肝脏组织和HepG2.2.15细胞中，miRNA-373和miRNA-371-373簇的表达均显著上调[4]。人们通过研究发现，在1.3×HBV转染的HepG2细胞中，miRNA-373和miRNA-371-373簇的高表达可以通过靶向核因子I/B，刺激HBV蛋白和HBV核心DNA的产生，从而促进HBV的复制。由于miRNA是在细胞中产生的，而循环miRNA来自于凋亡或坏死的细胞、细胞的主动释放以及循环细胞的裂解，本研究应用实时荧光定量PCR方法检测miRNA-372/ 373在各组无偿献血者血浆中的相对表达水平，发现相比较于正常组，miRNA-372/373在E单阳组、EN双阳组无偿献血者血浆中的相对表达水平均明显上调（图1～2），由此看出，HBV感染者血浆中的miRNA-372/373与 HBV感染的肝脏组织和HepG2.2.15细胞中的miRNA-372/373表现是一致的。这一结果提示血浆中的miRNA-372/373与HBV感染密切相关。

另外，miRNA-372/373在EN双阳组的相对表达水平比在E单阳组上调更为明显。这是由于相对于E单阳组，EN双阳组献血者体内有较活跃的病毒复制且拷贝数较高，这一结果初步表明了血浆miRNA-372/373的相对表达水平不仅与HBV的感染相关而且与HBV的复制及活动性相关。

3.2 将EN双阳组中的miRNA-372/373相对表达水平与HBV DNA拷贝数做相关性分析（图3～4），miRNA-372/373的相对表达水平与HBV DNA拷贝数呈正相关关系。在组织和细胞中，miRNA-373和miRNA-371-373簇的表达水平与HBV DNA拷贝数呈正相关，miRNA-373和miRNA-371-373簇的高表达可以刺激HBV蛋白和HBV核心DNA的产生，从而促进HBV的复制[4]。因此我们推测，在血浆中，miRNA-373和miRNA-371-373簇也产生同样的作用，miRNA-372/373相对表达水平的高低可以反应此时的HBV复制情况。同时，miRNA-373的相对表达水平与HBV DNA拷贝数的正相关性更为明显。

综上所述，miRNA-372、miRNA-373的相对表达水平与HBV早期感染密切相关，有望为HBV早期感染的诊断和治疗提供新的依据和方法。当然，对于临床研究来说，本试验中的血浆样品数量偏少，只有54份，因此本研究得出的结论有一定的局限性，仅供参考，相关研究还有待进一步深入探讨。

[1] Lee R C,Feinbaum R L,Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5)：843

[2] Nikaki A,Piperi C,Papavassiliou A G.Role of microRNAs in gliomagenesis：targeting miRNAsin glioblastoma multiforme therapy[J].Expert Opin Investig Drugs,2012,21(10)：1475

[3] Kwak M S,Lee D H,Cho Y,et al.Association of polymorphism in Pri-microRNAs-371-372-373 with the occurrence of hepatocellular carcinoma in hepatitis B virus infected patients[J]. PLoS One,2012,7(7)：e41983

[4]Guo H Y,Liu H Y,Mitchelson K,et al.MicroRNAs-372/373 promote the expression of hepatitis B virus through the targeting of nuclear factor I/B[J].Hepatology,2011,54(3)：808

[5] Chen C F,Ridzon D A,Broomer A J,et al.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR[J].Nucleic Acids Res,2005, 33(20)：e179

[6]曾洋，刘星霞，林瑞竹，等．microRNA-373参与调控人脂肪来源间充质干细胞成骨分化[J]．基础医学与临床，2012，32（2）：119

[7] 武卫华，孔璟，叶彬．hsa-mir-373对肿瘤细胞中E-钙黏蛋白表达的影响[J]．生物技术通报，2011（8）：167

[8]刘琳，王月玲，王江芬．miR-21、miR-126、miR-143和miR-373在正常宫颈组织、宫颈癌组织及Hela细胞中的表达差异[J]．四川大学学报：医学版，2012，43（4）：536

（2015-04-23收稿）

Differential expression of miRNA-372/373 in plasma between the normal donors and the HBV donors at early stage

AN Peng-peng1，TANG Hua2，GUO Jun-fei2
（1.Department of Quality Control,Tianjin Blood Center,Tianjin 300110，China；2.Tianjin Life Science Research Center,Tianjin Medical University,Tianjin 300070，China）

Objective：To explore the relationship between the miRNA-372/373 levels in plasma and the early-stage infection of HBV,to uncover the potential of miRNA-372/373 in the diagnosis of the early-stage infection of HBV.Methods：Blood samples for miRNA detecting were collected from 54 donors who donated blood from 2013.3 to 2013.9 in Tianjin.All the samples were divided into 3 groups：eighteen samples were Normal;18 samples were ELISA testing(+)and NAT(-)(HBV-S);the last 18 samples were ELISA testing(+)and NAT(+)(HBV-D).Quantization of miRNA-372 and miRNA-373 in all the 54 plasma samples were performed using quantitative RT-PCR. At last,compared thederegulated miRNA(miRNA-372/-373)in the plasma of the three groups respectively,and the expression patterns of miRNA-372 and miRNA-373 were analyzed using statistical methods;the correlation between the expression level of miRNA-372/-373 and the copy number of HBV DNA in NAT(+)plasma was statistically analyzed.Results：Compared with the Normal,miRNA-372 and miRNA-373 in both HBV-S and HBV-D were up-regulated.Furthermore,both miRNA-372 and miRNA-373 were up-regulated more significantly in HBV-D than in HBV-S.Moreover,the levels of both miRNA-372 and miRNA-373 were positively correlated with the copy number of HBV DNA in HBV-D.Compared with miRNA-372,miRNA-373’s positive correlation with the copy number of HBV DNA was significantly higher.Conclusion：The correlation between miRNA-372/373 in plasma and the early-stage infection of HBV is high, indicating their potential values in the early-stage diagnosis of HBV infection.

microRNA;miRNA-372;miRNA-373;the early-stage infection of HBV

R457.1

A

1006－8147（2015）06-0503-04

安蓬蓬（1979-），女，主治医师，硕士在读，研究方向：输血；通信作者：汤华，E-mail：htang2002@yahoo.com。