郭晓蕾，施 斌，张 婷

(无限极(中国)有限公司，广东广州 510641)



乳源黄嘌呤脱氢酶和黄嘌呤氧化酶的晶体结构研究概述

郭晓蕾，施 斌，张 婷

(无限极(中国)有限公司，广东广州 510641)

在全球范围内，高尿酸血症近年来发病率逐渐提高。黄嘌呤脱氢酶(XDH)、黄嘌呤氧化酶(XO)等是参与痛风发生与发展的关键酶，是开发抗痛风药物的重要靶标。通过抑制嘌呤代谢关键酶活性，可有效降低血浆尿酸水平。本文主要概述了在2.1-Å分辨率下牛乳来源的二聚XDH的晶体结构及在2.5-Å分辨率下XO的晶体结构，发现每个分子由一个含两铁硫中心的氨基端20 kDa域、一个中央40 kDa黄素腺嘌呤二核苷酸域和一个85 kDa钼喋呤结合域。此外，对黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶的主要变化历程进行概述。

黄嘌呤脱氢酶；黄嘌呤氧化酶；晶体结构

乳源黄嘌呤氧化酶是一种典型的酶，最初被认为是一种醛氧化酶，后来充当了整个复杂金属黄素蛋白质类的基准物[1]。黄嘌呤氧化还原酶可从各种各样的生物(微生物、人等)中分离获得。它能广泛地催化嘌呤、嘧啶、喋呤和醛类的羟基化反应[2-3]。催化次黄嘌呤和黄嘌呤羟基化的哺乳动物酶，即作用在尿酸形成的最后2个步骤，可以合成脱氢形式的黄嘌呤脱氢酶(XDH)，并且在细胞主要以这种形式存在，但很容易被含巯基残留物氧化或发生水解作用，而转化为氧化形式的黄嘌呤氧化酶(XO)。XDH在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)反应区域，催化反应向NAD+减少的方向进行，然而XO不与NAD+反应，就只能将分子氧作为反应底物，生成超氧化物阴离子和过氧化氢[2]。黄嘌呤氧化还原酶类是一种针对痛风和高尿酸血症的药物，可将XDH转化成XO，因其涉及氧自由基诱发组织损伤类型疾病(如缺血后再灌注损伤等)已受到广泛关注。最近研究表明，XO还可能具有降血压的作用[4]。

黄嘌呤氧化还原酶类的活化型是分子质量达290 kDa的同型二聚体。每个单体在反应中发挥着各自的催化作用。每个亚基有1个钼喋呤辅因子、2个不同光谱[2Fe-2S]中心和1个FAD辅因子。黄嘌呤的氧化发生在钼喋呤中心(Mo-pt)，电子进而通过分子内电子转移迅速分配到其他中心。与其他羟化酶不同的是，XDH最终用一个水分子作为氧原子来源并入产物中。

来自各种来源的黄嘌呤氧化还原酶类的氨基酸序列已通过单独反向转录DNA(cDNAs)或基因工程推导出来。这些酶类约由1 330个氨基酸组成，而且高度同源，例如牛奶酶类(1 332个残基)中90%的氨基酸序列与人类肝脏酶(1 333个残基)具有同一性[2,5-6]。哺乳动物的XDH用胰蛋白酶限制性蛋白水解作用后，可得到3个片段(分子量分别为20、40和85 kDa)，与此同时自身将转化为黄嘌呤氧化酶。序列经对比后表明，2个铁硫中心位于在N端20 kDa片段，黄素腺嘌呤二核甘酸(FAD)位于中间40 kDa片段，而钼中心位于C端的85 kDa片段[2]。

表1 收集到和修正的统计数据

注：Rcryst=Σhkl︱Fobs-Fcalc︱/Fobs，Fob和Fcalc是观察和计算的结构系数，反射总和也相应地用于优化模型。

XO晶体可以从牛奶的酶类中提纯出来，但提取的量并不足以用作更深入的分析。由于缺乏对黄嘌呤氧化还原酶2种形式中任意一种的结构信息，这类酶的结构-机制相关性研究仅通过远亲酶类推断出来，如来自巨大脱硫孤菌属的醛氧化酶(ALO,23% FeS-和Mo-pt域同一性；醛氧化酶缺乏黄素辅因子域)和来自食羧假单胞菌的一氧化碳脱氢酶(COD,17%的S、M和亚基具同一性)[7-9]。尽管这种方法为反应机理提供良好的模型，特别是钼喋呤亚位点[4,8]，但几乎没有关于FAD位点的相关信息。显然，现在仅通过观察包括人类和老鼠这2种哺乳动物的黄嘌呤氧化还原酶类催化活性变化，还不能理清从原来的XDH形式变化到XO形式伴随着的结构变化历程。有文献展示了牛奶黄嘌呤氧化还原酶在2.1-Å分辨率下XDH形式和在2.5-Å分辨率下的XO形式。通过对比这2种分子结构，可以识别出诱导XDH转变成XO所发生的重要蛋白水解变化。

1 鉴定黄嘌呤脱氢酶、黄嘌呤氧化酶的方法

按照Nishino等方法制备XO形式的酶[10]。为了制备稳定和可结晶的XDH，对已建立的提纯方法进行改进，用去除蛋白酶的脂肪酶水解方法代替用标准胰酶制剂或丁醇处理的方法，是其中最重要的一步。在复杂的水杨酸抑制剂环境中可以提高XDH和XO形式晶体的衍射质量。牛奶XDH晶体属于C2空间群，晶胞参数a=169.9 Å，b=124.8 Å，c=148.6 Å，β=90.9°，还包含在不对称单位的2个亚基。XO在空间群的晶胞参数a=117.8 Å，b=167.7 Å，c=154.5 Å，还包含在不对称单位的一个亚基。在100 K状态下，分别收集从2.1-Å分辨率下XDH到2.5-Å的XO速冻晶体的参数。MAD数据是测量3个波长段峰附近的XDH晶体而得到 (表1)。所有数据组均用DENZO和SCALEPACK方法处理[11]。结合分子置换(MR)和XDH的Fe/S中心的铁原子反相，可探明XDH和XO的结构。最初分子置换法是以XO的原始数据和一个D.gigasALO亚基作为搜索模型[12]，运用分块切除术项目演变而来。因为搜索模型未涉及辅因子，此时相应位置可见的电子密度就担当一个额外检验方案正确性的指示剂角色。XO晶型的解决方案提出0.231的相关系数 (CC)和一个57.4%的R因子(R)，然而平均背景值CC= 0.189，R=59.0%。二聚体是由分子置换法XO晶体对称性定义的，一个关于XDH的重要方案发现CC=0.263，R=56.1%，而并非平均值为CC=0.205，R=58.2%。由MAD的解决方案[13]可知，4个铁位点可以相当于SOLVE程序中XDH晶体里4个预期Fe/S集群。然而，利用以上信息尚不能获得单一铁原子的定位信息。因此，计算过程完全基于MAD的信息，但未能充分阐释电子密度图。一旦分子置换方案确认了Fe/S集群的位点，定义了Fe/S集群的取向，MAD阶段将在SHARP程序应用下提升到数据全析的高度[14]。最终的参数为离心0.42，中心反射0.38。为充分利用这2个独立来源的相位信息，部分重建和改进模型相结合，MAD阶段将按照程序SIGMAA执行[15]。溶剂扁平化和在4.0 Å下以平均2倍密度的相延伸会在DM中发生[16]。由此产生的电子密度图就可以在O程序辅助下大致追踪每个亚基中1 280个片段[17]。这个模型使用程序CNS而得到进一步校正，通过27.3%的R因子 (游离 R =30.0%)得以修正。内含2 049个水分子(平均B-因子为39.8Å2)的XDH模型通过非晶体学对称的约束条件，用19.8%的R-因子(Rfree=23.8%)进行修正。经修正后XDH模型转移到XO电子密度图中，经CNS程序校正，将通过O程序进行重建[18]。在最后的模型中，XO结构内含597个水域(平均B-因子为51.1 Å2)， 由21.2%的R-因子 (Rfree=27.5%)校正。表1中列出的是收集到的参数和修正数据。

2 黄嘌呤脱氢酶、黄嘌呤氧化酶的结构对比

XDH二聚体的分子结构主要分成3个区域和2个连接环。从N末端到 C末端，出现的分别域是铁/硫中心域(3～165残基)、FAD域(226～531残基)和Mo-pt域(590～1331残基)。

XDH单体可以分为3个域。小N端域(1～165残基)有铁/硫辅助因子，并且通过166～225个残基组成的长条物，连接到第2个FAD-捆绑域 (226～531残基)， 其中第166～191个残基是看不到电子密度的。FAD域由另一个连接段(532～589残基)连接到第3个域，连接段部分无序，晶体结构中也看不到第532～536个残基的结构。第590～1 332个残基的第三个大域隔离了靠近结合Fe/S和FAD域界面的钼喋呤辅因子。C端第1 310～1331个残基在晶格中接触到另一个分子，使得它们在电子密度更清晰可见。然而，在不断变化中，它们很可能是无序的C末端晶体。

因为密度不足而消失在XDH模型中的残基位于分子表面。亮氨酸Leu 219和赖氨酸Lys 569的胰酶位点切割的C端残基位于多变的FAD域连接段。在老鼠XDH中，胰蛋白酶切断Lys 184和Lys 551后部。这些残基属于相应的连接段，但是只有这种Lys 551的酶切割方式才能导致转换[19]。这种温和的蛋白水解能将XDH同型二聚体转换成一对异三聚体，亚基结构与生理活性相同[9]。这2种氨基酸之一的半胱氨酸Cys 992被氟二硝基苯修饰，引发XDH和XO形式之间的可逆转换，成为Mo-pt域的一部分[19]。位于连接FAD域和Mo-pt域多变段的Cys 535是另外一个被该反应修饰的残基。

2.1 钼喋呤域尽管目前的分辨率水平还不能仅依靠电子密度确定束缚钼离子的原子化学性质，但之前文献报道已确定3个配体和2个喋呤辅因子亚硫酸盐[3]。在XDH结构中，氧化型酶中有一个双键硫原子、双键氧原子和一个作为钼离子配体的单键氧原子。单键氧原子是从溶剂水中补给钼中心的，会在催化反应中被转移作为酶反应基底[13]。在用于结晶的蛋白质制备中，约25%的XDH含有一个硫原子被一个氧原子取代的Mo-pt非活性中心。为了保护Mo-pt的活性部位，可在2种酶形式的提纯和结晶过程中，加入1 mol/L水杨酸钠。水杨酸盐已被证实是一种与钼活性部位底物竞争性结合的抑制剂[2-3]。在XDH晶体结构中，在活性部位距离钼离子6.5 Å处发现有水杨酸分子。尽管水杨酸本身不绑定到Mo-pt辅因子，但是它阻碍生成金属络合物的潜在基底通道。

水杨酸分子通过几个氢键和静电相互作用稳定在活性部位，其所含的一对羧酸盐原子靠近Arg 880的胍基(3.0和3.1 Å)；同时，它们也绑定到Thr 1010(3.0 Å) 的羟基侧链以及通过水分子230通道绑定到Glu 1261的羧酸盐。钼离子附近的Glu-H2O相互作用已被D.gigasALO结构预测推断出来[7-8]。水杨酸的羟基使得酰胺主干和Thr 1010 (分别为3.2和2.9 Å) 的羟基侧链之间形成氢键。芳香族抑制剂与距离3.5 Å的Phe 914环平行对齐，但2个芳香环仅略有重叠。同时，Phe 1009的苯基环通过最近距离为3.7 Å的通道，与水杨酸环中心发生交互侧立。基于以上研究结果，可以建立二环底物结合模型，例如有垂直于黄嘌呤六元环的Phe 1009，还有位于底物五元环顶上的能与其中一个钼配体形成共价键的Phe 914叠加平面。活性部位有几个有序排列的水分子，但由于有水杨酸和氧化性辅因子的存在，还不能确定具体是由哪个水分子提供氧原子，进而并入产物中。

2.2 铁/硫域XDH的N端域包含2个结构排列非常类似于D.gigasALO[7]和O.carboxidovoransCOD[9]中铁硫域的Fe/S绑定簇子域。N端子域有一个[2Fe-2S]簇。它能协调至Cys 43、Cys 48、Cys 51、Cys 73，并且位于接近核黄素环的7α，8α-甲基团[20]。C端子域则有一个四螺旋束，其簇能在Mo-pt活性部位协调至Cys 113、Cys 116、Cys 148和Cys150。

根据各自不同的电子顺磁共振信号(EPR)，分别指定两个簇为Fe/S I和Fe/S II。Fe/S I的信号与菠菜铁氧还蛋白中的相似，而且在温度达到40 K时易观察到。然而，另一个Fe/S II的信号大体上是更大片的线条，而且只可在低于22 K时观察得到[3]。这2个簇的氧化还原势也不同于在-235 mV下测得Fe/S II的氧化还原势和在-310 mV 25 ℃下测得Fe/S I的氧化还原势[21]。至于大鼠肝酶，这2个EPR信号通过定点诱变分配给各自的排列基序。绑定到非一般C端簇 -Cys-Xaa2-Cys-//-Cys-Xaa1-Cys- 的图形显示了Fe/S I信号，而Fe/S II信号是属于N端簇的[22]。通过结合电子顺磁共振测量和晶体研究成果，可了解COD的等价分配[23]。

有趣的是，替换的Cys 43可以通过丝氨酸作为Fe/S II中心的一个铁原子配位体，导致它的EPR谱和氧化还原势发生变化[22]。与此相反，Cys 51位的类似突变却对另一个铁原子配体的特性无明显影响。晶体结构显示了铁a与核黄素7α甲基的碳原子有7.8 Å的距离。与最近Fe/S I的铁原子有12.4 Å的距离。这两段间距明显要比Cys 51配体铁原子b间距、FAD或Fe/S I辅因子中的最近原子间距 (分别为8.1和14.1 Å)小得多。钼铁间距和Fe/S I簇最短铁原子间距是14.7 Å，确立了基于2个顺磁中心间的计算估计量为14 Å。根据上述几何分布及中心的氧化还原势，电子从钼原子到2个Fe/S中心的转移是一个热力学有利的变化过程[24]。除Mo-pt和Fe/S I的相互作用(Mo-pt的2个氨基取代基和Cys150的Sγ之间的范德华力)，明显没有连接其他辅因子的“贯穿绑定”通道。既然它们的间距比14 Å要小，那么隧道效应是最可能的电子运输机制[25-26]。

2.3 FAD域FAD域是黄素蛋白家族的远亲，还包含香草基醇氧化酶(VAO)和UDP-N-乙酰基烯醇式丙酮酸葡萄糖胺还原酶 (MurB)。MurB是一种参与细菌细胞壁生物合成的酶[27]。COD的FAD绑定亚基M是该家族另一个成员。将XDH的FAD域和COD进行比较后，发现当该域被分成2个子域后与XDH中的残基413和COD中的残基176有更精确的匹配。当将XDH中残基233～413的Cα原子位置与COD中残基5～176的进行比照时，显示出1.4 Å的均方根偏差。而另一半FAD域 (XDH中残基 414～526和COD中残基177～285)均方根偏差是1.7 Å。虽然相比于XDH， COD中黄素环位置倾斜到结合囊中，但是2个域之间的相似点也延伸到围绕异咯嗪环嘧啶部分的氢键模式。FAD并合成一个处于深裂中的扩展构象，其异咯嗪环在Si-面上高度亲溶剂。NAD分子有足够的空间伸展烟酰胺环方向，使之与异咯嗪平行。畜禽类如鸡的XDH残基Tyr 419经亲和标记后，使用对氟磺酰苯甲酰腺苷盐酸盐进行NAD结合干扰[28]。畜牧类如牛的XDH中相应的残基(Tyr 393)位于靠近FAD结合裂缝的表面。可以想象的到，如此庞大的基团被加入到其环中足以阻碍与NAD的结合。尽管有FAD辅因子的便捷通道，XDH却展现出相对较低的氧活性。酶基质中黄素中性半醌的稳定化处理，可以用来阐明这个现象[2]。

在黄素辅因子一侧的Phe 337侧链，与异咯嗪环嘧啶部分发生π-π反应。相当于牛奶XDH中Phe 337的残基，被保留在已知的黄嘌呤氧化还原酶中，畜牧类如牛的ALO芳香族氨基酸为亮氨酸所取代。还应该指出的是，Asp 429带负电荷的侧链距离黄素的C6只有3.6 Å，附近并没有直接电荷补偿。只有几个环绕着Asp 429的水分子依次与FeyS II醛酮类主干结合成环。一般的静电效应可以通过异咯嗪环和一些醛酮类主干间7α-和 8α-甲基原子团短时间接触而增加。8α-甲基碳原子距离Thr 262的羰基3.5 Å，距离Glu 45的羰基3.3 Å。7α-甲基碳原子则距离Gly 46的羰基3.2 Å。Glu 45和Glu 46属于Fe/S II中心的紧密循环结合，同时将Fe/S 簇与黄素环分隔开。

2.4 XDH和XO形式的比较XDH和X O的电子密度图之间最明显的区别在于， XO的图中没有更长的多肽链，如在XDH的氨基酸529～570组成一个α螺旋、一个β折叠和一个环，共同跨越约70 Å的距离。尽管可以把在XDH晶体结构丢失的电子密度归属于相应的残基迁移率(酶在十二烷基磺酸钠SDS凝胶中以单波段运行)，可想而知在XO形式中，考虑到蛋白水解物的性质，丢失的氨基酸实际上是从蛋白质分子中迁移了。XDH和XO的全折叠依然非常相似，在2个Fe/S中心或附近和Mo-pt中心无观显著变化。XDH和XO中结合Fe/S域和Mo-pt域之间Cα位置的均方根偏差为889Cα原子的0.34 Å。一般的结构保持与动力学研究相一致，说明2种结合酶的形式之间和Mo-pt中心用于催化的底物间无显著性差异[2]。从XDH到XO的可逆转换可以通过修饰Cys 535和Cys 992而获得[19, 29]。Cys 992的Cα原子和残基537相距 15.7 Å。二硫键的形成是其中一种可能的转换机制。关于氧化性XDH/XO转换的更加深入的结构解释，要等半胱氨酸修饰蛋白的晶体衍射特性明晰之后才能得到。XDH的胰蛋白酶水解作用于Lys 551后或胰酶裂解Leu 219和Lys 569后，导致XO不可逆转的转换。XO分子晶体可通过胰酶水解作用制备出来，因此其可能是在Leu 219和Lys 569后被裂解。但是，在XO中，它们依然是两段高度活跃或不存在的链中延伸碎片的一部分。

FAD的活性位点发生了从XDH转换为XO最大变化的酶的一部分[2-3]。令人惊讶的是，所有在转换过程起作用的氨基酸都位于FAD域活性位点裂解入口的对立侧。它们距离黄素辅因子至少有18 Å，因此直接影响FAD周围结合位点的残基定向是不大可能的。但是，在XDH中，Phe 549周围的链紧贴着Arg 427的侧链；因断裂成肽链而去除这种XO的交互作用，可能引发大量穿过对面黄素环Si侧的高度带电荷环(Gln 423-Lys 433)的结构重排。这种转换从它与黄素环的C6原子近距离接触，进而用Arg 426侧链取代它作为黄素最近的基团，最终清除Asp 429的侧链，也彻底改变黄素外界的静电势。在这个过程中，一些XDH形式的酶残基相对于原来的位置移动了多达20 Å。相比之下，在XDH到XO的转换过程中，除堆叠越过黄素嘧啶部分的Phe 337有轻微移动外，黄素环re侧的结构性特性在很大程度上未受到干扰。

2种形式酶间发生的静电分歧强有力地证明了先前发现的XDH 通过多于4个pH单位转移了可电离取代基的pK的研究。假设Gln 423-Lys 433环的新位置之后，限制了基底NAD+通向 FAD辅因子的通道。这种变化在没有干扰交替基底、氧气和异咯嗪环间的相互作用前提下限制了脱氢酶活性。动力学差异以及XDH和XO的氧化还原反应可以解释NAD+结合位点的存在，同时FADH/FADH2对能够大幅降低还原电位，相当于在XDH和XO的黄素半醌稳定化处理。

3 小结与展望

哺乳动物的黄嘌呤氧化还原酶类，主要催化尿酸形成的最后2个步骤，可以合成脱氢形式的XDH，但也很容易被含巯基残留物氧化或发生蛋白水解作用，而转化为氧化形式的XO。XDH外露闭环的裂解，导致类似于黄素闭环(谷氨酰胺Gln 423-赖氨酸olys 433)主要结构的重排。该转化历程将部分阻碍把烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)基质变化成FAD的辅助因子，减少活性部位的静电环境变化，反映这2种形式酶的底物专一性转化。但是，为了更好地界定从XDH转换到XO的结构依据，需要用更高的分辨率去扩展对XDH和XO的分析。

[1] MASSEY V,HARRIS C M. Milk xanthine dehydrogenase: the first one hundred years[J]. Biochem Soc Trans,1997, 25:750-755.

[2] HILLE R,NISHINO T.Flavoprotein structure and mechanism.: Xanthine oxidase and xanthine dehydrogenase[J]. FASEB J,1995, 9:995-1003.

[3] HILLE R. The Mononuclear Molybdenum Enzymes[J]. Chem Rev,1996, 96:2757-2816.

[4] SUZUKI H,DELANO F A,PARKS D A,et al.Xanthine oxidase activity associated with arterial blood pressure in spontaneously hypertensive rats[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1998, 95: 4754-4759.

[5] BERGLUND L,RASMUSSEN J T,ANDERSEN M D,et al.Purification of MUC1 from bovine milk-fat globules and characterization of a corresponding full-length cDNA clone [J].J Dairy Sci,1996,79:198-204.

[6] ICHIDA K, AYAMA Y, NODA K, et al. Mapping of the gene for human xanthine dehydrogenase (oxidase)(XDH) to band p23 of chromosome 2[J]. Gene,1993, 133:279-284.

[7] ROMAO M J,ARCHER M,MOURA I, et al. Crystal structure of the xanthine oxidase-related aldehyde oxido-reductase fromD.gigasof outstanding interest[J]. Science,1995,270: 1170-1176.

[8] HUBER R, HOF P,DUARTE R O,et al. The functional form of the aldehyde oxidoreductase fromDesulfovibriogigas[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1996, 93:8846-8851.

[9] DOBBEK H,GREMER L,MEYER O,et al. Crystal structure and mechanism of CO dehydrogenase, a molybdo iron-sulfur flavoprotein containing S-selanylcysteine[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:8884-8889.

[10] NISHINO T, NISHINO T,TSUSHIMA K.Purification of highly active milk xanthine oxidase by affinity chromatography on sepharose 4B/folate gel[J]. FEBS Lett,1981, 131:369-372.

[11] OTWINOWSKI Z. Data collection and processing[C]//SAWYER L,ISAACS N,BAILEY D. Proceedings of the CCP4 Study Weekend. Warrington, U.K: Science and Engineering Research Council Darsbury Laboratory,1993:52-62.

[12] KISSINGER R K, GEHLHAAR D K,FOGEL D B. Rapid automated molecular replacement by evolutionary search[J]. Acta Crystallogr D,1999, 55: 484-491.

[13] TERWILLIGER T C,BERENDZEN J. Automated MAD and MIR structure solution[J]. Acta Crystallogr D,1999, 55:849-861.

[14] DE LA FORTELLE E,BRICOGNE G. Maximum-likelihood heavy-atom parameter refinement for the multiple isomorphous replacement and multiwavelength anomalous diffraction methods[J]. Methods Enzymol,1997,276: 472-494.

[15] READ R J. Model phases: probabilities and bias[J]. Methods Enzymol,1997,277:110-128.

[16] COWTAN K D,MAIN P. Phase combination and cross validation in iterated densitymodification calculations[J]. Acta Crystallogr D,1996, 52:43-48.

[17] JONES T A,ZOU J Y,COWTAN S W,et al. Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models[J]. Acta Crystallogr A,1991, 47:110-119.

[18] BRU¨NGER T A,ADAMS P D,CLORE G M,et al. Crystallography & NMR System: A new software suite for macromolecular structure determination[J]. Acta Crystallogr D,1998,54:905-921.

[19] NISHINO T,NISHINO T.The Conversion from the Dehydrogenase Type to the Oxidase Type of Rat Liver Xanthine Dehydrogenase by Modification of Cysteine Residues with Fluorodinitrobenzene[J]. J Biol Chem,1997,272:29859-29864.

[20] STICHT H, RO¨SCH P. The structure of iron-sulfur proteins[J]. Prog Biophys Mol Biol,1998,70: 95-136.

[21] HUNT J,MASSEY V,DUNHAM W R,et al.Redox potentials of milk xanthine dehydrogenase[J].J Biol Chem,1993,268:18685-18691.

[22] IWASAKI T,OKAMOTO K,NISHINO T,et al. Sequence motif-specific assignment of two [2Fe-2S] clusters in rat xanthine oxidoreductase studied by site-directed mutagenesis[J]. J Biochem (Tokyo),2000, 127:771-778.

[23] GREMER L,KELLNER S,DOBBEK H,et al.Binding of Flavin Adenine Dinucleotide to Molybdenum-containing Carbon Monoxide Dehydrogenase fromOligotrophacarboxidovorans[J]. J Biol Chem,2000,275: 1864-1872.

[24] COFFMAN R E, BUETTNER G R. General magnetic dipolar interaction of spin-spin coupled molecular dimers. Application to an EPR spectrum of xanthine oxidase[J]. J Phys Chem,1979,83: 2392-2400.

[25] MARCUS R A,SUTIN N. Electron transfers in chemistry and biology[J]. Biochim Biophys Acta,1985, 811:265-322.

[26] PAGE C C,MOSER C C,CHEN X,et al.Natural engineering principles of electron tunnelling in biological oxidation-reduction[J]. Nature (London),1999,402: 47-52.

[27] FRAAIJE M W,MATTEVI A. Flavoenzymes: diverse catalysts with recurrent features[J]. Trends Biochem Sci,2000,25:126-132.

[28] NISHINO T,NISHINO T. The nicotinamide adenine dinucleotide-binding site of chicken liver xanthine dehydrogenase: evidence for alteration of the redox potential of the flavin by NAD-binding or modification of the NAD-binding site and isolation of a modified peptide[J]. J Biol Chem,1989,264:5468-5473.

[29] RASMUSSEN J T,RASMUSSEN M S,PETERSEN T E. Cysteines Involved in the Interconversion Between Dehydrogenase and Oxidase Forms of Bovine Xanthine Oxidoreductase[J]. J Dairy Sci,2000, 83: 499-506.

Study on Xanthine Dehydrogenase and Xanthine Oxidase Structure from Dairy

GUO Xiao-lei, SHI Bin, ZHANG Ting

(R&D Infinitus (China) Ltd, Guangzhou, Guangdong 510641)

Recent years, hyperuricemia has became more and more popular worldwidely. Xanthine dehydrogenase (XDH) and xanthine oxidase (XO) are two key enzymes that participate the occurrence and the development of gout, which are very important targets for gout therapy. By inhibiting those enzyme activities, the uric acid level in blood plasma could be decreased. The crystal structure of the dimeric (Mr, 290,000) bovine milk XDH at 2.1-Å resolution and XO at 2.5-Å resolution were presented. Besides, the major changes that occur on the proteolytic transformation of XDHto the XO form were described as well.

Xanthine dehydrogenase; Xanthine oxidase; Structure analysis

郭晓蕾(1975-)，女，辽宁铁岭人，中级工程师，硕士，从事保健食品开发。

2014-12-17

S 188；TS 202.3

A

0517-6611(2015)04-001-04