反向高效液相色谱法紫外测定缬沙坦含量的方法学研究

2015-02-27陈岚张震华谢之微

西部医学 2015年3期

陈岚张震华谢之微

（上海交通大學附属瑞金医院药剂科，上海卢湾200025）

缬沙坦（Valsartan），化学名为（S）－N－戊酰基－N－｛［2′－（1H－5－四氮唑－基－1，1′－联苯）－4－基］－甲基｝－缬氨酸。缬沙坦结构中含1个手性碳原子，产品为S－构型。结构式见图1。

图1 缬沙坦结构Fig 1 Effect of valsartan structure

缬沙坦是一种口服有效的特异性的血管紧张素Ⅱ（AT1）受体拮抗剂［1］，它选择性地作用于AT1受体亚型，阻断AngⅡ与AT1受体的结合（其特异性拮抗AT1受体的作用大于AT2受体约20000倍），从而抑制血管收缩和醛固酮的释放，产生降压作用［2］。不作用于血管紧张素转换酶（ACE）、肾素和其它受体，不抑制与血压和钠平衡有关的离子通道；该品对血管紧张素转换酶没有抑制作用，不影响体内缓激肽水平，因而导致咳嗽的副作用少于血管紧张素转换酶抑制剂。

国家食品药品监督管理局标准（YBH01882012）以及英国药典（BP2012）缬沙坦标准含量测定方法分别为酸碱滴定法及电位滴定法，见表1。采用酸碱滴定法进行含量测定时，对滴定终点颜色判断不明显，定量误差较大，重现性差；采用电位滴定法时，需要N2对滴定过程保护，操作费时，方法复杂［3］。本文采用高效液相色谱法对含量进行控制，结果该方法专属性高，方法简便，快速、准确，重现性好，消耗样品量少。适合作为缬沙坦原料的质量控制。本研究中缬沙坦由湖南千金湘江药业股份有限公司研制生产。

表1 缬沙坦质量标准中含量项下的对比Table 1 Comparison on assay determination of Valsartan in quality standards

1 材料与方法

1．1 仪器与试药 Agilent 1260高效液相色谱仪；UV－762紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；BS110S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。缬沙坦对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号为100651－201203，含量99．8%；缬沙坦原料6批（批号20121001～20121003，20121101～20121103）由湖南千金湘江药业股份有限公司生产。甲醇、乙腈均为色谱纯，磷酸氢二钠为分析纯；水为二次重蒸水。

1．2 方法

1．2．1 色谱条件采用 Waters Symmetry C18柱（150mm×4．6mm，5μm），用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈－水－冰醋酸（500∶500∶1）为流动相；检测波长为225nm；流速为1．0ml／min。理论板数按缬沙坦峰计算应不低于4000，缬沙坦与相邻杂质峰的分离度应符合要求。

1．2．2 溶液制备取本品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml约含缬沙坦0．05mg的样品溶液；另取缬沙坦对照品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml约含缬沙坦0．05mg的对照品溶液。

1．2．3 线性关系及标准曲线精密称定缬沙坦10mg，置50ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，分别精密量取2．5、2．5、4、5、6和7．5ml，置100、20、20、20、20和20ml量瓶中，制成5、25、40、50、60和75μg／ml 6个浓度范围，用流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取各溶液10μl，分别注入色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标（Y），浓度（μg／ml）为横坐标（X）进行线性回归，回归方程为Y＝7．266x＋0．0627，r＝0．9999。缬沙坦在5～75μg／ml浓度范围内线性良好。

1．2．4 精密度试验精密吸取同一供试品溶液10μl，连续进样6次，记录色谱图，分别于第二天、第三天重复上述操作。主峰峰面积的RSD＝1．1%（n＝18）。说明仪器精密度良好。

1．2．5 重复性试验取“1．2．2”项下方法制备的同一份供试品溶液5份，分别再次重复测定5次，计算含量，RSD＝1．4%。说明方法的重复性良好。

1．2．6 稳定性试验取本品适量，精密称定，用流动相溶解并稀释至刻度制成每1ml中含0．05mg的溶液。取上述液作为供试品溶液，置室温下放置，分别于第0、2、4、6、8、10、12h时，测定峰面积，RSD＝0．6%。说明样品溶液稳定性良好。

1．2．7 回收率试验精密称取缬沙坦20、25和30mg，分别置50ml容量瓶中，加流动相30ml，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液5ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取缬沙坦对照品适量（以干燥品计），精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含0．05mg的溶液。按外标法以峰面积计算供试品中缬沙坦的含量，计算平均回收率。结果缬沙坦高、中、低3个加入量的回收率（n＝3）分别为99．96%（RSD＝1．2%）、100．12%（RSD＝1．6%）、100．08%（RSD＝1．4%），平均值（n＝9）为100．06%。

1．2．8 定量项取线性试验项下浓度为5μg／ml溶液，逐级稀释对照品溶液，测定样品峰的峰高，同时测定相同条件下的色谱基线噪声，取基线噪声的10倍值为定量限，连续进样6次，记录色谱图，因此本品定量限为0．5ng（0．1%）。

2 结果

2．1 HPLC测定缬沙坦含量取6个批次的样品各2份，分别按照“1．2．2”项下方法制备供试品溶液，按色谱条件测定，结果见表2、图2。

表2 缬沙坦含量试验结果Table 2 Determination results of assay（HPLC）

图2 RT＝9．659缬沙坦；RT＝7．428丁酰基缬沙坦Fig．2 RT＝9．659Stan；RT＝7．428Ding Xianji Stan

2．2 酸碱滴定测定缬沙坦含量同时取以上样品，按照中国药典（2010年版）缬沙坦含量测定方法进行酸碱滴定，结果见表3。

表3 缬沙坦含量试验结果Table 3 Determination results of assay（titration）

3 讨论

3．1 有资料报道，测定缬沙坦含量的方法中，HPLC法检测分析缬沙坦的波长为270nm［4］，而药品缬沙坦试行标准HPLC的检测波长为230nm。在本试验中，依据紫外分光光度法，在200～400nm波长范围内进行测定，结果在225、230、270nm处波长都有吸收，然而在225nm处吸收峰最大，因此将230nm设定成检测波长。在流动相不改变的情况下，流速减小，吸收主峰出现时间推迟，增大流速，吸收主峰出现时间缩短；且主吸收峰及杂质吸收峰的拖尾因子f、分离度R、理论塔板数n均满足规定。改用其他类型的C18柱，如 Waters Novpak C18柱（150mm×3．9mm，5μm），Waters Symmetry C18柱（250mm×4．6mm，5μm），在不改变流动相的前提下，出峰时间单纯只受柱长的影响，短柱出峰时间稍短，长柱出峰时间略长。且主吸收峰及杂质吸收峰的拖尾因子f、分离度R、理论塔板数n均满足规定。

3．2 液相色谱法将液体作为流动相。经典液相色谱法通常使用普通规格的流动相以及固定相在常压下进行输送待测样品，此种色谱法的分离时间长且柱效不高［5］。采取高效液相色谱法可分析检测对象广，柱效高。该方法只要求待测样品能被制成溶液即可，不需气化，因而不受样品挥发度的限制。尤其是对检测挥发度小、对热不稳定、离子型化合物及摩尔质量大的化合物有利，例如抗生素、核酸、甾体、蛋白质等［6］。

3．3 高效液相色谱分辩率高于其它色谱法，速度快，十几分钟到几十分钟可完成［7］，重复性高，自动化操作，分析精确度高。酸碱滴定法是基于酸碱反应的滴定分析方法，其操作误差主要与滴定条件、指示剂、终点判断以及操作水平等影响因素有关。

3．4 丁酰基缬沙坦是缬沙坦原料中主要控制杂质之一，其与缬沙坦主要区别在于正丁酰基。在用滴定法进行含量测定时，易使含量测定结果偏高。采用高效液相色谱进行含量测定时，缬沙坦与丁酰基缬沙坦有效分离，含量测定结果准确，方法专属性高，简便，快速，准确，重现性好。