洪震，傅冰，傅金尧，陈盛专，季国华

(1. 丽水市林业科学研究院，浙江 丽水 323000；2.丽水职业技术学院，浙江 丽水 323000； 3.浙江省平阳林场，浙江 平阳 325406；4.遂昌九龙山自然保护区，浙江 遂昌 323312)

中华野海棠遗传多样性分析

洪震1，傅冰2，傅金尧2，陈盛专3，季国华4

(1. 丽水市林业科学研究院，浙江 丽水 323000；2.丽水职业技术学院，浙江 丽水 323000； 3.浙江省平阳林场，浙江 平阳 325406；4.遂昌九龙山自然保护区，浙江 遂昌 323312)

利用SRAP-PCR方法研究了8个不同种源中华野海棠的遗传多样性。结果表明：8个中华野海棠种质资源被划分为2大类群，其中遂昌、景宁、庆元、泰顺、武夷山种源聚成1个类群；平阳、松阳、云和种源聚成另外个类群；遗传相似性系数界于0.4230～0.9615，平均相似性系数为0.71。

SRAP-PCR；中华野海棠；遗传多样性

中华野海棠(Brediasinensis)，为野牡丹科野海棠属常绿灌木，花瓣粉红色至紫红色，优美艳丽，叶形美观，叶色翠绿有光泽，叶与花均有很高的观赏价值[1]。同时，该种具有较高的药用价值，全株供药用，在浙江民间常用其治小儿腹泻、感冒、头痛以及疟疾等病症[2]。中华野海棠主要分布于两广、江西、浙江、福建等省，浙江省则分布于丽水、温州等浙南山区，通常在海拔400～1400m的山谷、山坡、林下等地有生长。

目前，对于中华野海棠的研究较少，主要集中在移栽培养[3]、抗逆性研究、化学成分分析[4]、生物学特性[5]研究等方面，而对于遗传育种、分类鉴定等方面，现有报道均未涉及。利用SRAP技术分析不同种源的中华野海棠的遗传多样性，可为分类鉴定以及良种选育等工作提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

表1 供试材料

1.1.1 中华野海棠种植资源。供试8种中华野海棠种质资源(表1)采集于浙江及福建各地。采集鲜嫩叶片后，-70℃超低温冰箱保存。

1.1.2 SRAP引物及筛选。共选择了6个正向引物，8个反向引物用于实验筛选，具体如表2，引物由北京全式金生物技术有限公司按照相关序列合成。

表2 引物序列

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取。用全氏金公司PlanZol植物基因组提取试剂盒抽提中华野海棠叶片组织的基因组DNA。利用琼脂糖凝胶电泳检测所提取基因组DNA的完整性，并用Lambda 650紫外分光光度计(PE，美国)测定浓度及质量。

1.2.2 SRAP-PCR反应体系及程序。参考前期对蓝莓SRAP-PCR反应体系及参数的研究[6]，初步确定反应体系及反应程序。初步确定反应体系为：dNTPs 100 μmol/ L、Taq 酶0.8U、MgCl22.5 mmol/ L、DNA 40 ng、正、反向引物各0.2 μmol/ L、1×Reaction Buffer(总体积20 μL)。PCR反应程序为： 95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，35 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，5个循环；95 ℃变性45 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，30个循环； 72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.3 SARP引物筛选。以松阳种源中华野海棠基因组DNA为模板，随机组合正、反向引物，进行引物筛选。

1.2.4 电泳及染色。将筛选得到的引物分别以所有供试中华野海棠基因组DNA为模板进行PCR反应，并进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用Dolphin-DOC Plus凝胶成像系统(Wealtec，美国)分析、记录数据。DNA标准分子量为MarkerIII(北京全式金生物技术有限公司)。

1.2.5 数据处理和统计方法。用Dolphin-DOC Plus凝胶成像系统自带软件结合人工方法读带，并记录扩增结果，其中有带记为1，无带记为0，并导入Excel表格。用NTSYS-pc2.10e分析软件分析所得Excel表格，计算遗传相似性系数，同时用UPGMA对不同种源进行聚类分析，绘制聚类图。

2 结果与分析

2.1 引物筛选及多态性分析

以松阳种源中华野海棠基因组DNA为模板，验证PCR反应体系及反应程序，同时筛选合适的SRAP引物组合。共随机组合了20对引物组合，电泳结果如图1所示，从中筛选出4对能够扩增出清晰的条带，并且多态性好、稳定性高的引物组合，分别为：ME4-EM17、ME4-EM18、ME5-EM13、ME6-EM10。筛选结果同样证明该PCR体系是适用的。4对组合PCR后经3.5%丙烯酰胺凝胶电泳，共扩增出99条条带，其中多态性条带为60条，多态性比率为60.61%(表3)。

表3 9个引物组合的扩增结果

图1 引物筛选电泳图

2.2 种质资源相似性系数分析

根据4对组合PCR电泳结果(图2为ME6-EM10引物组合电泳结果)，利用NTSYS-pc2.10e分析软件计算样品间的Jaccard遗传相似性系数，结果见表4。8个中华野海棠种质资源的遗传相似性系数分布于0.4230～0.9615之间，平均相似性系数为0.71。其中，最高相似性系数出现在遂昌和景宁种源之间，为0.9615；最低相似性系数出现在福建和云和种源之间，为0.4230。

表4 8个中华野海棠种质资源的Jaccard相似性系数矩阵

图2 ME6-EM10 3.5%丙烯酰胺凝胶电泳图

2.3 种质资源的聚类分析

图3 8个中华野海棠种质的UPGMA聚类图

基于Jaccard遗传相似系数的UPGMA聚类图(图3)显示，8个中华野海棠种质资源被划分为两大类群：其中遂昌、景宁、庆元、泰顺、福建种源聚成一个类群(I)；平阳、松阳、云和种源聚成另一个类群(II)。类群I又可以细分成2个小的类群，其中，福建种源自成一类类群，其它4个种源为一个类群。类群II同样也可细分成2个小的类群，分别为松阳、云和种源为一个类群；平阳种源为另一个类群。

3 讨论

通过对试验结果的分析，8种供试种质资源遗传相关性并不是很高，说明中华野海棠具有较丰富的遗传多样性。虽然除了福建武夷山种源的中华野海棠外，其它7个种质资源均采集自浙江省丽水市及温州市，但是这7个种质资源之间并没有因为分布较近而表现出高的亲缘关系，这可能跟种质资源的人工移栽、自然迁移[7]等因素有关。

[1]洪震，李根有，马丹丹，等.野生花卉中华野海棠的抗逆性研究[J]．北方园艺，2012(5)：62-66.

[2]屠娟丽，周紫球，吴小华.3野生灌木中华野海棠的发芽试验[J]．浙江林业科技，2003 (2)：24-26.

[3]张作焕，李林，陶正明.中华野海棠野生苗移栽技术初探[J]．浙江林业科技，2003(1):54-55.

[4]沈双玲.中华野海棠化学成分及药效学分析[D]．福州：福建农林大学，2013.

[5]马丹丹，金清.3种野海棠属野生花卉的光合特性研究[J]．河南林业科技，2011(3):1-3.

[6]傅冰，洪震，刘跃钧，等.蓝莓SRAP-PCR反应体系的建立和优化及其遗传多样性分析[J]．北方园艺，2013(17)：95-99.

[7]钟永德，李迈和.Norbert Kraeuchi，地球暖化促进植物迁移与入侵[J]．地理研究，2004(3):347-353.

Analysis the Genetic Diversity ofBrediasinensis

Hong Zhen1，Fu Bing2，Fu Jinyao2，Chen Shengzhuan3，Ji Guohua4

(1. Lishui Academy of Forestry, Lishui ，Zhejiang 323000；2.Lishui vocational & technical college, Lishui , Zhejiang,323000; 3.Pingyang Forest Farm of Zhejiang Province,Pingyang,Zhejiang 325406；4. Jiulongshan Nature Reserve of Suichang,Suichang, Zhejiang 323312)

SRAP-PCR method was used to study the genetic diversity of 8Brediasinensisprovenances.The results indicated that: the 8Brediasinensisprovenances were divided into two groups,which provenances of Suichang County, Jingning County, Qingyuan County, Taishun County,Wuyishan City together into one group; and the other group include provenances of Pingyang County, Songyang County, Yunhe County.The GS coefficients among the 8Brediasinensisprovenances were ranged from 0.4230 to 0.9615 with an average of 0.71.

SRAP-PCR;Brediasinensis;Genetic diversity

2015-08-25

浙江省科技计划项目(2013C32102)；丽水市科技计划项目(20120310)

洪震(1969-)，男，高级工程师，主要从事观赏植物开发利用研究，E-mail:452451651@qq.com。

S661.4

B

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.06.001