郭　华, 颜卫红, 李玉娟, 丁　惠

(山东省东营市人民医院, 1. 儿科; 2. 血液科; 3. 手术科, 山东 东营, 257000)

感染中枢神经系统肠道病毒的分子生物学分型研究

郭华1, 颜卫红1, 李玉娟2, 丁惠3

(山东省东营市人民医院, 1. 儿科; 2. 血液科; 3. 手术科, 山东 东营, 257000)

摘要:目的探讨感染中枢神经系统肠道病毒(EV)的分子生物学分型。方法收集脑炎患儿脑脊液(CSF)样本72例，以EV71、COXB3、ECHO30标准病毒株为阳性对照，脑外科手术患儿CSF为阴性对照。采用通用引物和2种分型引物对CSF样本进行扩增，并对扩增产物进行分型研究。结果利用通用引物1次和2次PCR EV阳性检出率分别为69.44% (50/72)、73.61% (53/72), 差异无统计学意义(P>0.05)；对VP1段进行PCR扩增, 1次和2次PCR后，阳性检出率分别为26.42% (14/53)、62.26% (33/53)，差异有统计学意义(P<0.01); 对VP2段进行PCR扩增，1次和2次PCR后，阳性检出率分别为16.98% (9/53)、54.72% (29/53), 差异有统计学意义(P<0.01); 2种分型引物对EV RNA阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05); EV阳性样本与EV标准毒株相关序列同源性均在97%以上。结论利用分型引物能够检测临床常见EV的大多数血清型，可为防治EV引起的中枢神经系统感染提供临床参考。

关键词:肠道病毒; 逆转录聚合酶链反应; 脑炎; 中枢神经系统感染; 分子生物学分型

肠道病毒(EV)属小RNA病毒科，因寄居于肠道而得名，有近70个血清型，包括柯萨奇病毒A1～23型、柯萨奇病毒B1～6型、埃可病毒1～31型、脊髓灰质炎病毒1～3型及新型肠道病毒68～71型[1]。EV是引起人类感染的最常见病原体之一，各年龄阶段均可发病，轻者为无症状感染，重者可引起脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎、心肌炎、手足口病等疾病，甚至死亡[2-3]。随着抗生素的广泛应用和卡介苗的普遍接种，化脓菌和结核菌造成的脑膜炎、脑炎的发病率日趋降低，而病毒性脑膜炎、脑炎日益增多，已成为中枢神经系统感染的最常见疾病[4]。本研究通过分子生物学中2次RT-PCR法，对EV感染阳性者进行分型研究，从而深入探寻EV的实验室及临床检测方法，为今后防治EV引起的中枢神经系统感染提供理论基础和临床参考。

1资料与方法

1.1　一般资料

选择2013年9月—2014年12月山东省立医院集团东营医院收治的病毒性脑炎患儿72例为研究对象，均根据临床表现、影像学检查、脑电图等确诊。其中男47例，女25例；年龄0.5～11岁，平均(5.39±2.11)岁；急性期38例，恢复期34例。另选同期行脑外科手术患儿17例作为阴性对照，均无临床感染症状，血常规及生化指标正常。其中男9例，女8例；年龄1～12岁，平均(5.61±1.97)岁。本研究经医院伦理委员会批准，所有患儿家属知情同意。

1.2　方法

1.2.1样本收集：脑炎患儿于入院当天及恢复期分别抽取脑脊液(CSF)1.0 mL, 行细菌培养基常规检查。选择细菌培养阴性及糖、蛋白质、氯化物等定量均正常的脑外科手术患儿CSF为阴性对照；采用EV71、COXB3、ECHO30标准病毒株为阳性对照，以外科手术患儿CSF和磷酸盐缓冲液稀释。

1.2.2RNA提取及RT-PCR：采用改良的异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取病毒RNA。提取完毕后立即常规逆转录合成cDNA、进行PCR扩增。以阳性对照和阴性对照来确定反应的正确性，所有PCR扩增阴性或电泳条带较弱的样本，取扩增产物作为模板进行二次PCR。2次PCR后，EV阳性的CSF样本利用分型引物分别对VP1段和VP2段进行RT-PCR，PCR扩增阴性或电泳条带较弱的样本，取扩增产物作为模板进行二次PCR。

PCR引物序列(知行生物科技有限公司设计合成)

通用引物15'-TCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT-3'25'-CACYGGATGGCCAATCCA-3'VP115'-MIGCIGYIGARACNGG-3'25'-CICCIGGIGGIAYRWACAT-3'VP215'-GARGCITGYGGITAYAGYGA-3'25'-TTDATCCAYTGRTGIGG-3'

1.2.3扩增产物琼脂糖凝胶电泳：PCR扩增产物5 μL加入1 μL loding buffer中，在含有1.5 μg/mL溴化乙锭染色的2%琼脂糖凝胶上，120 v电泳30 min后，置于波长为300 nm紫外灯下观察电泳条带。

1.2.4EV型别确定：2种分型引物经2次PCR均获得阳性结果的样本中，随机选出20例，回收纯化产物，测定序列，测序结果采用BLAST程序与GenBank数据库中EV标准毒株对比，进行同源性分析。

1.3　观察指标

比较不同引物PCR检测病毒性脑炎CSF样本的结果；分析EV临床毒株与GenBank数据库中EV标准毒株的同源性。

2结果

2.1　通用引物RT-PCR检测结果

EV71、COXB3、ECHO30标准病毒株经扩增及电泳后，均显示一条清晰的单克隆带，约194 bp, 无非特异性扩增；所有阴性对照样本扩增产物电泳后均无明显条带；72例脑炎患儿CSF样本1次PCR后，阳性检出率为69.44%(50/72), 剩余阴性样本进行2次PCR后，阳性检出率为13.64%(3/22), 即2次共检出阳性样本53例(73.61%), 1次和2次PCR后EV RNA的阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、2。

注: 1为标准毒株扩增产物, 2～9为部分脑炎

注: 8为标准毒株扩增产物, 1～7为阴性

对照组样本扩增产物，M为Marker

图2阴性对照组通用引物RT-PCR扩增产物电泳图

2.2　2种分型引物RT-PCR检测结果比较

对VP1段进行PCR扩增，产物为357 bp的片段，1次PCR后阳性检出率为26.42%(14/53),2次PCR后阳性检出率为62.26%(33/53), 差异有统计学意义(P<0.01); 对VP2段进行PCR扩增，产物为584 bp的片段，1次PCR后阳性检出率为16.98%(9/53)，2次PCR后阳性检出率为54.72%(29/53), 差异有统计学意义(P<0.01); 2种分型引物对EV RNA阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、4。

注：1为标准毒株扩增产物，2～7为部分

注: 7为标准毒株扩增产物，1～6为

部分脑炎患儿样本扩增产物，M为Marker

图4针对VP2段设计引物RT-PCR扩增产物电泳图

2.3　EV临床毒株与GenBank数据库中EV

标准毒株同源性分析

20例阳性样本与EV标准毒株相关序列同源性均在97%以上。其中2例与ECHO30、1例与COXA11同源性高达99%; 2例与COXA9同源性为98%; 7例与COXB3、5例与ECHO12、2例与COXA7、1例与COXB5同源性均为97%。

3讨论

EV为临床常见病原体，但长期以来病原诊断困难[5]。传统EV诊断与定型方法为用敏感细胞培养病毒，然后用EV组合血清进行型别鉴定。该法耗时长、操作繁琐，常出现无法定型的分离株[6]。其原因主要有: ① 20%以上血清型的EV，如柯萨奇病毒A组，难以在单层组织细胞中生长[7]; ② 组合诊断血清并未包括所有血清型别，WHO推荐使用的RIVM诊断组合血清，只能鉴定出54.39%的型别[8]; ③ 2种及以上病毒混合感染或1种病毒聚集成团，必须通过脱氧胆酸钠或氯仿或超滤处理使其分散后才能定型; ④ 病毒抗原变异，出现新血清型。这些原因导致免疫学诊断敏感性低、特异性差，检查结果不能及时指导急性期疾病的临床诊治。而脑组织活检会侵害脑组织，严重地限制了其应用。

近年来，RT-PCR已逐步应用于多种疾病的病原学检测中，在临床检测EV病原体方面同样具有高敏感性、高特异性、操作简单等优点[9]，能使低丰度的mRNA被扩增放大易于检测[10]。Piralla等[11]采用实时荧光定量RT-PCR检测呼吸道EV-D68，Pabbaraju等[12]利用多重实时荧光定量RT-PCR检测不同型别的EV，均获得较高的灵敏度和特异性。

本研究采用RT-PCR方法，以通用引物对3株阳性标准毒株、72例脑炎临床标本及阴性对照组进行扩增检测，结果显示，阳性标准毒株经RT-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，产物均显示一条长度约为194 bp的单克隆带，条带清晰、无非特异性扩增；所有阴性对照样本均不能被扩增检测。表明以通用引物进行RT-PCR检测方法特异性强、可靠性高。在72例临床诊断为脑炎的CSF样本中EV阳性检出率为73.61%, 与国内外相关研究基本一致[13-15], 表明在脑炎患儿中，EV仍是占第一位的病原体。随机抽取的20例阳性样本全部成功分型，表明通用引物与分型引物检测的特异性高，提示应用分型引物结合EV标准毒株序列比较，能够克服传统血清学分型的缺点，为进一步治疗提供指导。

参考文献

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Study on molecular biological types of enterovirus

infecting central nervous system

GUO Hua1, YAN Weihong1, LI Yujuan2, DING Hui3

(1.DepartmentofPediatrics; 2.DepartmentofHematology; 3.DepartmentofSurgery,

People′sHospitalofDongying,Dongying,Shandong, 257000)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the molecular biological types of enterovirus (EV) that could infect central nervous system (CNS). MethodsA total of 72 samples of cerebrospinal fluid (CSF) from children with encephalitis were collected, with standard viral strain EV71, COXB3 and ECHO30 as positive control and CAF from children underment brain surgery as negative control. The CSF samples were expanded by using common primers and 2 type primers so as to conduct type research on the expanded products. ResultsThe positive detection rates once and twice after the application of reverse transcriptase polymerase chain reaction (PCR) with common primers were 69.44% (50/72) and 73.61% (53/72), respectively, but the difference was not significant (P>0.05). PCR expansion was conducted to VP1 segment, and the positive detection rates once and twice after the application of PCR with common primers were 26.42% (14/53) and 62.26% (33/53), respectively (P<0.01), which were 16.98%(9/53) and 54.72%(29/53) after the PCR expansion to VP2 segment (P<0.01). Moreover, there was no significant difference between the two primers in detecting EV (P>0.05). The homology of relevant sequences in VE positive samples and EV standard viral strains was more than 97%. ConclusionThe application of type primers can detect the most serum types of EV, thus providing clinical reference for the prevention of EV-induced CNS infection.

KEYWORDS:enterovirus; reverse transcriptase polymerase chain reaction; encephalitis; central nervous system; molecular biological type

基金项目:中国高校医学期刊临床专项资金(11520926)

收稿日期:2015-01-20

中图分类号:R 373.2

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)09-097-04

DOI:10.7619/jcmp.201509028