丁佳利，魏星鑫，任小凤

星点设计-效应面法优化哈蟆油腺嘌呤提取工艺

丁佳利1*，魏星鑫2，任小凤2

目的 采用星点设计-效应面法优选哈蟆油中腺嘌呤的提取工艺。方法 采用HPLC测定腺嘌呤含量，以Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)为色谱柱，流动相甲醇-水，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长260 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL。以腺嘌呤为考察指标，通过星点设计-效应面法考察甲醇浓度、提取时间、提取温度对哈蟆油腺嘌呤提取工艺的影响。结果 腺嘌呤对照品进样量在17.73～110.33 μg/mL呈良好线形关系，回归方程为Y=0.104 5 X+0.100 1，R2=0.999 6，平均回收率为97.84%，RSD为1.76%(n=6)。最佳提取工艺为甲醇浓度73%，提取时间68 min，提取温度61 ℃，哈蟆油得率为465.30 μg/g。结论 优选的哈蟆油腺嘌呤提取工艺简便、稳定。

哈蟆油；腺嘌呤；星点设计-效应面法；HPLC；提取工艺

0 引言

哈蟆油(Oviductus ranae)为蛙科动物中国林蛙(Rana temporaria chensinensis David)雌蛙输卵管经采制干燥而得[1]，始载于《神农本草经》并列为上品，《本草纲目》中称之“山哈”，别名哈士蟆油、哈蟆、雪蛤，富有滋补“软黄金”的美誉[2]。哈蟆油成分丰富，主要含有多糖、维生素、蛋白质[3]、磷脂、脂肪[4]、蛙醇、脂肪酸、胆固醇[5]、微量元素[6]、人体必需氨基酸和激素等。药理研究表明，哈蟆油具有抗缺氧、抗衰老[7]、抗疲劳、调节血脂、镇咳祛痰和增强机体免疫力等作用。

腺嘌呤作为一种重要的核苷类成分，是生物遗传信息的组成部分，还是ATP、多种酶的辅因子(如乙酰辅酶A、辅酶A转移酶等)及细胞通讯媒介的必需部分，在细胞的生长、分裂和蛋白质的合成过程中起着关键作用[8-9]；其磷酸盐有刺激白细胞增生的作用，用于防治各种原因引起的白细胞减少症，特别是由于肿瘤化疗、放射治疗及苯类等药物中毒所造成的白细胞减少症[10]。

本试验采用星点设计-效应面法优选哈蟆油中腺嘌呤的提取工艺，以腺嘌呤得率为响应值，使用Design-Expert 8.0.6软件分析，优化提取溶剂甲醇的浓度、提取时间和提取温度。

1 仪器和试药

1.1 仪器 Dionex UltiMate 3000高效液相色谱仪，配置包括四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、恒温柱温箱、DAD检测器，变色龙色谱数据工作站；Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm ×4.6 mm,5.0 μm)色谱柱；梅特勒XS-105电子分析天平(0.01 mg，METTLER TOLEDO，Switzerland)；R-201恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)。

1.2 试药 哈蟆油(批号：140601；产地：东北)购自浙江中医药大学中药饮片有限公司，哈蟆油于液氮中研细保存备用；腺嘌呤对照品(批号：110886-201102；含量：99.4%)购自中国药品生物制品检定所；提取用甲醇为分析纯，水为娃哈哈纯净水，液相用甲醇为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 哈蟆油腺嘌呤提取单因素考察 试验首先考察影响哈蟆油腺嘌呤提取各单因素之间的水平差异，再筛选相关因素并合理设计因素水平，进行响应面优化试验。

2.2 甲醇浓度在哈蟆油腺嘌呤提取中的影响 称取哈蟆油粉约0.1 g，精密加入水，20%、40%、60%、80%甲醇和甲醇溶液各15 mL，于60 ℃条件下水浴加热提取60 min，过滤，取续滤液进行含量测定分析，结果见图1。

图1 甲醇浓度在哈蟆油腺嘌呤提取中的影响

由图1可知，水作为溶剂提取哈蟆油腺嘌呤得率为303.68 μg/g，20%、40%甲醇相较于水得率略微升高，但无明显变化。60%甲醇提取哈蟆油腺嘌呤得率达到最高值为472.14 μg/g，随着甲醇浓度的升高，提取效果也逐渐减弱，甲醇得率最低为202.45 μg/g，故选取40%、60%、80%三个浓度的甲醇溶液进行优化试验。

2.3 料液比在哈蟆油腺嘌呤提取中的影响 称取哈蟆油粉约0.1 g，分别以料液比1∶25、1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250精密加入60%甲醇溶液，于60 ℃条件下水浴加热提取60 min，过滤，取续滤液进行含量测定，结果见图2。

试验过程中观察到，哈蟆油具有很强的膨胀性。在料液比1∶25条件下，未能对哈蟆油腺嘌呤充分提取。随着料液比的增大，哈蟆油腺嘌呤的得率渐渐增加，在1∶150下达到466.31 μg/g，而随着料液比的继续增大，无明显变化，故试验以料液比1∶150进行试验。

图2 料液比在哈蟆油腺嘌呤提取中的影响

2.4 提取时间在哈蟆油腺嘌呤提取中的影响 称取哈蟆油粉0.1 g，精密加入60%甲醇溶液15 mL，于60 ℃水浴加热提取15、30、60、90、120、150 min，过滤，取续滤液进行含量测定，结果见图3。

图3 提取时间在哈蟆油腺嘌呤提取中的影响

由图3可知，提取15 min，哈蟆油腺嘌呤得率为228.31 μg/g，在60 min时达到最高值476.08 μg/g，但随着提取时间的继续增加，哈蟆油腺嘌呤得率反而下降，故试验选取30、60、90 min三个时间水平进行优化试验。

2.5 提取温度在哈蟆油腺嘌呤提取中的影响 称取哈蟆油粉0.1 g，精密加入60%甲醇溶液15 mL，分别于40、50、60、70、80、90 ℃条件下水浴加热提取60 min，过滤，取续滤液进行含量测定，结果见图4。

由图4可知，在40 ℃时，哈蟆油腺嘌呤得率为360.38 μg/g，随着温度的升高，腺嘌呤得率先相应增大，在60 ℃时达到475.36 μg/g，但随着温度的继续升高，腺嘌呤得率减小，在90 ℃时为373.62 μg/g，故试验选取50、60、70 ℃三个温度水平进行优化试验。

图4 提取温度在哈蟆油腺嘌呤提取中的影响

2.6 星点设计-效应面法

2.6.1 试验设计与结果 在单因素试验基础上，选择甲醇浓度、提取时间、提取温度为自变量，每个因素取3个水平，因素水平编码见表1，试验安排及结果见表2。

表1 哈蟆油腺嘌呤提取工艺星点因素水平

表2 哈蟆油腺嘌呤提取工艺星点试验安排

2.6.2 建立模型方程与显著性检验 应用Design-Expert 8.0.6软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到甲醇浓度、提取时间、提取温度与哈蟆油腺嘌呤得率之间的二次多项回归方程：Y=475.022+20.962 5 X1+17.057 5 X2+8.622 5 X3+9.452 5 X1X2-2.577 5 X1X3-6.497 5 X2X3-76.519 75 X12-42.534 75 X22-29.444 75 X32(R2=97.74%)，对上述回归模型进行显著性检验，结果见表3。

表3回归方差显著性检验表明，甲醇浓度(X1)、提取时间(X2)的线性效应和二次效应差异均有统计学意义(P<0.01)，说明在提取条件中，甲醇浓度和提取时间的变差会在一定程度上影响哈蟆油腺嘌呤得率的变化。

2.6.3 响应面分析及最优提取条件的确定 采用Design-Expert 8.0.6软件，依据回归方程来绘制响应面立体分析图及等高线，考察所拟合的响应面曲线的形状，三因素交互作用的响应面等高线及响应面立体图，如图5、图6所示。利用该图可以对哈蟆油腺嘌呤得率的条件中任何2种因素的交互效应进行分析和评价。与之对应的实测值为甲醇浓度X1=73.16%，提取时间X2=68.03 min，提取温度X3=60.89 ℃，此时哈蟆油腺嘌呤得率最大估计值为459.12 μg/g。因此，确定哈蟆油中腺嘌呤的最佳提取工艺为甲醇浓度73%，提取时间68 min，提取温度61 ℃。

2.6.4 验证性试验 称取哈蟆油粉约0.1 g，6份，分别精密加入73%甲醇溶液15 mL于61 ℃水浴中加热提取68 min，过滤，取续滤液进行含量测定，测得哈蟆油腺嘌呤得率分别为464.38、458.62、469.77、472.18、466.46、460.39 μg/g，平均值为465.30 μg/g，RSD值为1.13%。验证结果与预测结果较接近，说明该工艺可行。

3 哈蟆油腺嘌呤的HPLC测定

3.1 色谱条件 采用岛津 Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)色谱柱。以甲醇(A)-水溶液(B)为流动相梯度洗脱，具体如下：0～10 min，1%～5% A；10～15 min，5%～15% A；15～20 min，15%～20% A；20～30 min，20% A；30～35 min，20%～35% A；35～40 min，35%～1% A。流速1 mL/min，柱温25 ℃，检测波长260 nm，进样量为10 μL，腺嘌呤对照品及哈蟆油样品色谱图如图7所示。

3.2 标准溶液的制备 精密称取腺嘌呤对照品4.44 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，摇匀，为储备液。将储备液依次用甲醇稀释制备成17.73、20.07、44.13、88.27、110.33 μg/mL的标准液进行测定。

表3 回归模型方差分析

图5 优化工艺模型的等高线叠加图

图6 X1、X2、X3对腺嘌呤提取影响的效应面图

3.3 供试品溶液的制备 称取哈蟆油粉约0.1 g，精密加入73%甲醇溶液15 mL于61 ℃水浴中加热提取68 min，过滤，取续滤液进行含量测定。

3.4 线性关系考察 按“3.1”项下色谱条件，依次吸取17.73、20.07、44.13、88.27、110.33 μg/mL的腺嘌呤标准溶液各10 μL，以腺嘌呤吸收峰面积(Y)对质量浓度(X,μg/mL)进行线形回归，得回归方程：Y=0.104 5 X+0.100 1，R2=0.999 6，结果显示进样量在17.73～110.33 μg/mL范围内有良好的线性关系。

3.5 精密度考察 以44.13 μg/mL腺嘌呤标准溶液进行精密度考察。按“3.1”项下色谱条件，重复进样6次，测定峰面积，结果RSD为0.92%(n=6)，表明此条件下腺嘌呤具有良好的精密度。

图7 腺嘌呤标准品及哈蟆油样品色谱图

3.6 准确度考察 称取已知含量哈蟆油粉末6份，每份约0.1 g，取腺嘌呤标准品适量，按“3.3”项下优选出的方法进行提取制备，哈蟆油标准溶液和供试品溶液各进样10 μL，测得峰面积并计算含量，得平均回收率为97.84%，RSD=1.76%(n=6)。

3.7 稳定性考察 称取哈蟆油粉末约0.1 g，按“3.1”项下的方法提取制备，取供试液10 μL，分别在0、3、6、12、24 h对哈蟆油样品进样分析，在24 h内其峰面积分别为4.813 2、4.591 4、4.612 5、4.773 8、4.698 5，RSD=2.06%(n=5)，表明供试液在24 h内稳定。

3.8 重复性考察 称取哈蟆油粉约0.1 g，6份，按“3.1”项下的方法提取制备，取续滤液进行含量测定，测得哈蟆油腺嘌呤得率分别为464.38、458.62、469.77、472.18、466.46、460.39 μg/g，平均值为465.30 μg/g，RSD值为1.13%，说明该提取工艺稳定。

4 结论

4.1 提取方法的选择 试验先对甲醇浓度、料液比、提取时间和提取浓度进行单因素试验，进而以Design-Expert 8.0.6为分析软件，进行响应面试验，筛选出以73%甲醇溶液为提取溶剂，在61 ℃水浴条件下提取68 min，哈蟆油腺嘌呤最高得率为465.30 μg/g。

4.2 检测方法的确定 HPLC检测腺嘌呤浓度在17.73～110.33 μg/mL范围内有良好的线性关系，且准确度高，稳定性强，重复性好，可作为哈蟆油腺嘌呤的检测方法。

4.3 哈蟆油的药用前景 哈蟆油是我国传统的中药，具有滋阴补肾的功效，现代药理研究表明，其对体弱气虚、病后失调、记忆力不佳、精力损耗、神经衰弱、心悸失眠等具有较好的疗效，是极具开发潜力的医疗、保健药品。

本试验以腺嘌呤为评价指标，对哈蟆油腺嘌呤提取和检测方法进行初步探索，为哈蟆油质量评价奠定一定基础。

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Optimization of extraction technology for adenine from oviductus ranae by central composite design/response surface methodology

DING Jia-li1*,WEI Xing-xin2,REN Xiao-feng2

(1.Zhejiang Provincial Hospital of TCM,Hangzhou 310006,China;2.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China)

Objective To optimize the process of extracting adenine from oviductus ranae by central composite design/response surface methodology.Methods The analysis was achieved with an Inertsil ODS-SP Extend C18column (250 mm×4.6 mm,5.0 μm) by gradient elution of methanol and water at 25 ℃.The flow rate was 1.0 mL/min,injection volume was 10 μL,and detection wave length was set at 260 nm.The effects of influence factors such as methanol concentration,extraction time and extraction temperature on extraction rate of adenine was investigated using box-behnken design and response surface method.Results The results indicate that the calibration curves of adenine have good linearity over the range from 17.73 to 110.33 μg/mL with a regression equation of Y=0.104 5 X+0.100 1,R2=0.999 6.The mean recovery was 97.84% (RSD=1.76%,n=6).Optimum processing conditions were: the concentration of methanol 73%,the extraction time was 68 min,the extraction temperature was 61 ℃ as the rate of adenine was 465.30 μg/g.Conclusion Optimized processing technology is simple and stable.

Oviductus ranae;Adenine;Central composite design-response surface methodology;HPLC;Extraction technology

2014-11-26

1.浙江省中医院,杭州 310006;2.浙江中医药大学,杭州 310053

浙江省中医药科学研究基金计划(2013ZA027)

10.14053/j.cnki.ppcr.201508019

*通信作者