杜夏夏，徐鹏

（辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁锦州121001）

弓形虫病免疫学诊断方法的研究进展

杜夏夏，徐鹏⋆

（辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁锦州121001）

弓形虫病是一种分布广泛危害严重的人兽共患寄生虫病，感染后无特征性临床症状，且病原学检出率低，而免疫学检测具有敏感、快速、便捷等特点，常用的弓形虫免疫学诊断方法有ELISA、IHA、MAT等，本文对近年来弓形虫病免疫学诊断方法的研究进展作以综述。

弓形虫病；免疫学；诊断技术

弓形虫是专性寄生于人与动物有核细胞内的寄生性原虫，1908年，法国人Nicolle、Manceaux在刚地梳趾鼠的肝脾单核细胞中发现该虫种，因其滋养体呈弓形，故命名为刚地弓形虫（Toxoplasma gondii），由其引起的疾病称为弓形虫病。该病给人畜造成严重危害，20世纪70年代猪的无名高热，其最终祸首就是弓形虫，猪群患病后表现为高热稽留（体温40～42℃）、呼吸困难、咳嗽、腹式呼吸；病猪精神沉郁，结膜发绀，皮肤出现紫红色淤斑，体表淋巴结特别是腹股沟淋巴结明显肿大，身体下部及耳部出现淤血斑或出现较大面积发紫，有的出现肠炎及神经症状；孕母猪发生早产或产出发育不全的仔猪或死胎。死后剖捡可见肺、肝、脾、淋巴结、心肌、脑等处均有炎性坏死性变化，显微镜下可见有多形性的滋养体，有的在心、脑、骨骼肌等处有休止期的包囊。猫作为弓形虫的终末宿主，感染后大多呈隐性或亚临床型经过而成为带虫者，只有少数出现临床症状。幼龄猫或机体处于应激状态时，可急性发作，临床表现为猫的体温升高，下痢、呼吸困难和肺炎，有的出现神经症状。成年猫多为带虫者，从粪便排出卵囊，感染其他宿主。

鉴于弓形虫病大多缺乏特异性临床症状，临床表现复杂多变，诊断较为困难。而免疫学诊断具有快速、准确、便捷等优点，是目前临床上常用的辅助诊断方法。弓形虫病急性期以检出弓形虫特异性IgM抗体或弓形虫循环抗原[1]作为可靠指标，也可观察特异性IgG抗体的动态变化；慢性期以检测弓形虫IgG抗体为主。检测抗弓形虫抗体或循环抗原的免疫学诊断方法主要有萨宾-费尔德曼染色试验（DT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接血凝试验（IHA）、间接荧光抗体试验（IFA）、改良凝集实验（MAT）、免疫胶体金技术等。本文对近年来弓形虫病免疫学诊断方法的研究进展作以综述。

1 萨宾-费尔德曼染色试验（DT）

该方法是弓形虫病所特有的免疫学诊断方法，其原理是弓形虫在与阴性血清作用后仍能被碱性美蓝染液深染，但与阳性血清（抗体）作用后则不着色或着色很淡。据此便可判断被检者血清中是否含有弓形虫抗体。该法的优点是特异性强敏感性高，感染后数天即可出现这种抗体，可用于早期诊断；缺点是所用抗原为活虫，安全性差，辅助因子较难获得，因此我国很少使用。

2 凝集试验

2.1 直接凝集试验（DTA）该方法的特点是简便快速，阳性反应出现时间比间接血细胞凝集试验（IHA）早。试验以甲醛固定的弓形虫悬液作为抗原与被检血清直接进行反应。在玻片上加不同稀释度的试验血清，混匀，几分钟后在显微镜下观察，如发生凝集，则为阳性反应。

2.2 改良凝集试验（MAT）在直接凝集试验基础上经美国学者Dubey等的改良和发展，显著提高了检测结果的敏感性和特异性，并将其称为改良凝集试验。该方法基本原理是将待检血清中的弓形虫特异性IgG抗体与速殖子表面抗原发生交联反应，通过伊文思蓝染色，在反应孔底部形成放大镜下可见的虫体抗原积层。至今，这种检测方法仍在欧美各国广泛用于人和动物弓形虫病的筛查，Dubey将几种免疫诊断技术比较后认为MAT是弓形虫抗体检测的金标准。

2.3 间接血细胞凝集试验（IHA）由于抗原与相应抗体结合而使载体颗粒发生凝集，称间接凝集，又称被动凝集。红细胞作为一种常见的抗原载体，用红细胞作为抗原载体的凝集反应称为间接血凝试验。反应原理是：将可溶性抗原致敏于红细胞表面，用以检测相应抗体，在与相应抗体反应时出现肉眼可见凝集。其临床意义在于弓形虫病的IHA一般在病后1个月左右出现阳性。血清抗体效价1:64为既往感染，1:256可能为近期感染，1:1 024为急性感染。IHA操作简单，敏感性高，适用于现场检测，可作为辅助诊断以及流行病学调查，缺点是重复性差，致敏红细胞不稳定。

3 酶联免疫吸附试验（ELISA）

酶联免疫吸附试验是20世纪70年代后期出现的一种标记免疫测定技术，经过不断的改进和完善，该法已成为十分成熟的免疫学诊断方法。它具有高度的敏感性和特异性，操作简便，不需特殊仪器设备，血样用量少，判断结果容易，现场应用方便，是目前符合现场需要的较好的免疫诊断方法。

现目前已开发出大量的弓形虫病ELISA诊断试剂盒，主要检测循环抗原（CAg）和特异性抗体（IgG、IgM），CAg比特异性抗体出现得更早，因此作为弓形虫感染的早期检测指标。特异性抗体的检测：弓形虫感染后，血液内最早出现的抗体是IgM，可在弓形虫感染后持续存在数周，因此IgM的检测可作为弓形虫病的早期诊断。而IgG在感染7 d后出现，但可存在较长时间。但由于IgG在感染者体内含量较高，因此易出现假阳性。因此多采用两种方法相结合的方式来提高检测的准确性。

3.1 斑点ELISA斑点ELISA（Dot-ELISA）比常规ELISA更灵敏、便捷、取材量少，因而迅速被推广应用，在1986年国外已应用于弓形虫病诊断。

3.2 PCR-ELISA 李健等[2]将生物素标记的PCR产物与地高辛标记的特异性探针杂交，再通过酶联显色反应测出OD值，以判断弓形虫感染情况，用该方法检测以104、103弓形虫RH株速殖子腹腔接种小鼠的全血、肝组织，结果PCR-ELISA方法的检测阈值为20 fg，其灵敏度是常规PCR的10倍，并且与人、小鼠疟原虫、旋毛虫等DNA均无交叉反应，同一样本重复测试5次，一致性良好，检测感染动物的肝组织及全血标本，104、103组分别在感染后第2天、第3天即可测出阳性，两种标本的阳性检出率无统计学差异，因此PCR-ELISA是一种快速、高效的测定方法，可应用于临床弓形虫病的诊断及流行病学调查等。

4 免疫胶体金技术（ICG）

目前，利用胶体金标记技术诊断弓形虫病的方法有免疫金银染色法（IGSS）、快速斑点免疫金渗透法（DIGFA）和胶体金免疫层析法（GICA）。

4.1 免疫金银染色法（IGSS）免疫胶体金染色法是一种较新的免疫诊断方法，其原理是胶体金探针与相应抗原或抗体形成抗原抗体复合物，经过银显影处理后，使金颗粒周围吸附大量银颗粒。由于银染色对金颗粒之信号有放大作用，所以敏感度很高。

4.2 快速斑点免疫金渗透法（DIGFA）应用硝酸纤维素膜（NC膜）作载体的免疫检测技术。先将抗原或抗体点于NC膜上，封闭后加待测样品，洗涤后用胶体金探针检测相应的抗原或抗体，通过金颗粒放大免疫反应系统，使反应结果在固相载体NC膜上显示。并将其装入充满吸水材料的渗滤装置中，装置分为底和盖，盖上一般有直径为0.5～0.8 cm的小孔。研究表明，该方法特别适合用于间接法检测抗体或捕获法检测IgG。黄菱等[3]建立了便捷、快速的斑点金免疫渗透法检测肿瘤病患者血清弓形虫IgG抗体，通过胶体金-SPA直接显色，阳性者出现红色斑点。用该法对232名肿瘤病患者血清和260名正常体检者血清进行检测，与IHA法对比检测，其结果具有良好的一致性。

4.3 胶体金免疫层析法免疫层析技术是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术、层析分析技术、单克隆抗体技术和新材料技术等多种方法有机结合的一种新型诊断技术。李昕等[4]用胶体金标记弓形虫单克隆抗体，制成检测宿主血清中的弓形虫循环抗原的胶体金免疫层析试剂条，用其检测了75份感染弓形虫速殖子后不同时间小鼠血清中的CAg及30份正常小鼠血清中的抗原，并与ELISA夹心法进行比较。两种方法检测高免弓形虫循环抗原的符合率为95%，胶体金免疫层析试剂条的灵敏度和ELISA相近。王艳华等[5]利用胶体金标记弓形虫代谢分泌抗原，利用双抗原夹心法研制出了弓形虫抗体金标检测试剂条，在对弓形虫阴、阳性血清检测中，与弓形虫IHA检测结果符合率为82.4%，其中弓形虫IHA检测阳性的血清金标试剂条全部为阳性，用金标试剂条检测人工感染弓形虫的兔血清，感染后第3天即可检测到抗体，而用间接血凝诊断试剂检测，感染后第5天才能检测到抗体，前者较后者提前2天检测到抗体。该试剂条法灵敏度明显高于IHA法，同时具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，适用于弓形虫病早期检测和诊断，特别适合在基层推广应用。

为探讨3种方法检测弓形虫IgG抗体的测试效率，杨亚晓等[6]通过使用金标记、间接血凝试验（IHA）和酶联免疫吸附（ELISA）的方法检测全部304个标本的弓形虫IgG抗体，并对其敏感性、特异性和约登指数进行了比较。金标记检测标法、间接血凝试验（IHA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测弓形虫IgG抗体的敏感性分别为85.5%、89.8%和91.9%；特异性分别为92.4%、96.6%和97.5%。酶联免疫吸附试验的检测效率和约登指数分别94.1%和89%，高于间接血凝试验（IHA）和金标记的方法。它检测弓形虫IgG抗体的敏感性和特异性较高，另外，它可以实现自动化，因此，是适合大型弓形虫IgG抗体筛查方法。

Khanaliha K1等[7]对基因重组抗原（SAG1、SAG2和SAG3）的诊断作用进行评价，并提供商业酶联免疫吸附法比较其功效。运用重组质粒转化到JM109菌株的致病性大肠杆菌，并进行表达和纯化。SAG1、SAG2和SAG3抗原使用酶联免疫吸附试验系统中不同组的血清和结果对照那些商业的IgG和IgM酶联免疫吸附试剂盒。重组表面抗原的抗弓形虫IgG与商用酶联免疫吸附试验敏感性和特异性检测结果如下：SAG1（93.6%和92.9%），SAG2（100.0%和89.4%）和SAG3（95.4%和91.2%），重组SAG2与商业酶联免疫吸附试验检测抗弓形虫IgG抗体没有观察到高度的一致（96.9%）。P22有检测抗弓形虫IgM与其他2基因重组抗原的最佳表现。重组SAG1、SAG2和SAG3可全部用于T抗体特异性抗体诊断弓形虫。并得到ELISA检测法具有特异性强、灵敏度高等特点。Shirbazou等[8]通过病例对照研究，考察了整体184份血清样品，包括91例糖尿病和93例非糖尿病患者的健康对照。血清样本作糖的酶法和酶联免疫吸附法（ELISA）检测抗弓形虫IgG抗体株，得到糖尿病患者和健康对照组弓形虫IgG抗体的患病率分别为60.43%和38%。糖尿病患者弓形虫感染的风险是健康对照组两倍高。感染艾滋病毒的患者感染弓形虫可导致致命的脑炎。诊断主要依靠示范寄生虫特异性抗体的血清。但艾滋病毒感染者,IgM经常检测不到，然而IgG仍然是探测在大多数。尿液样本很容易获得。Bhattacharyya等[9]研究观察到艾滋病毒感染患者血清和尿液样本中的抗弓形虫IgM和IgG之间无显著性差异。因此，尿液样本可代替血清进行弓形虫病的免疫诊断的研究。

5 展望

弓形虫病在免疫学诊断技术研究方面取得了较大进展，一些研究成果已经或正在对弓形虫病的防控产生重大作用。但目前弓形虫病免疫学诊断方面仍然存在一些问题，上述几种免疫学检测方法的敏感性、特异性都有不同的阈值，还有一定的局限性；用于诊断的抗原或抗体纯度不够；很多技术方法还不够成熟，只停留在试验阶段，未投入实践应用；目前用于弓形虫快速检测的诊断试剂盒数量少质量较差等。综上所述，开发新的弓形虫病诊断方法，把现有的经典的免疫学诊断方法进一步优化，这将是未来一段时间研究的方向。目前可根据现有的诊断资源，选择多种诊断方法相结合来提高诊断的特异性和敏感性，从而达到早诊断早确诊早治疗的目的，把弓形虫病患病风险及危害降到最低。

[1]Wang Y1,Yin H.Research progress on surface antigen1(SAG1)oftoxoplasmagondii[J]. Parasit Vectors,2014,7:180.

[2]李健，杨秀珍，梁东春，等.PCR-ELISA检测弓形虫实验研究［J］.中国人兽共患病学报，2006，22（4）：356-359.

[3]黄菱，李熊兵，赵瑞，等.斑点金免疫渗滤法检测肿瘤患者血清弓形虫IgG抗体的应用研究[J].寄生虫与医学昆虫学报，2005，12（1）：17-19.

[4]李昕，邸宝华，李会强，等.胶体金免疫层析法检测弓形虫循环抗原的研究[J].中国卫生检验杂志，2006，16（2）：149-151.

[5]王艳华，李克先，才学鹏，等.弓形虫抗体免疫胶体金快速检测试纸条的研制[J].中国兽医科学，2007，37（1），29-32.

[6]杨亚晓，陈玉昆，魏世锦，等.三种方法检测弓形虫IgG抗体的效能[J].中国血吸虫病防治杂志，2014，26（1）：109-110.

[7]Khanaliha K,Motazedian MH.Evaluation of recombinant SAG1,SAG2,and SAG3 antigens for serodiagnosis of toxoplasmosis[J].Korean J Parasitol,2014,52(2):137-142.

[8]Shirbazou S,Delpisheh A.Serologic detection of Anti toxoplasma gondii Infection in Diabetic Patients[J].Iran Red Crescent Med J, 2013,15(8):701-703.

[9]Bhattacharyya S,Khurana S.Anti-toxoplasma gondii antibody detection in serum and urine samples by enzyme-linked immunosorbent assay in HIV-infected patients[J].Indian J Pathol Microbiol,2013,56(1):20-23.

（编辑：张婷婷）

Research progress on immunological diagnosis of Toxoplasma gondii

Du Xiaxia,Xu Peng*

（College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Liaoning Medical University,LiaoningJinzhou121001）

Toxoplasmosis is a widespread serious zoonotic disease withno clinical symptoms after infection,and the low etiology detection rate.Immunological detection possess a sensitive,rapid,and convenient features.Commonly used immunological diagnostic methods include ELISA,IHA, MAT,etc.This papersummarized the recent studies on toxoplasmosis immunological diagnostic methods for reviewed.

Toxoplasmosis;Immunology;Diagnostic techniques

S852.62文献标识码：A文章编号：1672-9692(2015)02-0055-04

2015-01-11

杜夏夏（1993-），女，在读本科生，动物医学专业。

徐鹏（1979-），男，讲师，主要从事动物寄生虫病、人畜共患病教学科研工作。

辽宁省大学生创新训练项目（编号201410160019），辽宁省自然科学基金（编号2014022053）