张 健，李发鹏，甘天翊，许国军，何 卫，周贤惠，汤宝鹏，李耀东，郭 霞



·论著·

心功能不同的风湿性心脏瓣膜病心房颤动患者超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4的表达水平研究

张 健，李发鹏，甘天翊，许国军，何 卫，周贤惠，汤宝鹏，李耀东，郭 霞

目的 探讨超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)基因在风湿性心脏瓣膜病心房颤动伴心力衰竭患者与心功能正常的风湿性心脏瓣膜病心房颤动患者心房肌中的表达水平。方法 选取2008—2011年新疆医科大学第一附属医院因心脏瓣膜病需接受开胸换瓣手术患者45例，根据其心功能分级，将美国纽约心脏病协会(NYHA)分级为Ⅱ～Ⅲ级者27例作为试验组，将心功能正常者18例作为对照组。采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western-blotting)分别测定两组患者HCN4 mRNA及蛋白表达水平。结果 对照组HCN4 mRNA表达水平为(1.12±0.69)，低于试验组的(4.91±1.51)(t=0.021，P<0.05)。对照组HCN4蛋白表达水平为(1.02±0.15)，低于试验组的(2.01±0.92)(t=0.031，P<0.001)。结论 HCN4在心力衰竭与心功能正常的风湿性心脏瓣膜病心房颤动患者的心房肌中均有表达，且随着心功能不全的加重，HCN4表达水平上调。

风湿性心脏病；心房颤动；环核苷酸门控阳离子通道；心力衰竭

张健，李发鹏，甘天翊，等.心功能不同的风湿性心脏瓣膜病心房颤动患者超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4的表达水平研究[J].中国全科医学，2015，18(26)：3170-3172.[www.chinagp.net]

Zhang J，Li FP，Gan TY，et al.Expression level of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 4 in patients with atrial fibrillation associated with rheumatic valvular heart disease of different cardiac functions[J].Chinese General Practice，2015，18(26)：3170-3172.

随着人口老龄化的进展，心房颤动与心力衰竭(HF)伴随发生越来越常见。研究发现，按照美国纽约心脏病协会(NYHA)分级为Ⅱ～Ⅲ级的轻中度HF患者，其心房颤动发生率为10%～15%；NYHA分级为Ⅳ级的严重HF患者，其心房颤动发生率高达49.8%[1]。ACC/AHA/ESC 2006指南中明确指出HF是心房颤动的主要独立性风险因素之一[2]。心房颤动可以引起或加重原有HF，反之亦然。既往SOLVD研究明确表明，合并HF的心房颤动患者的病死率显著高于不合并HF的心房颤动者(HR=3.4)[3]。就目前而言两者之间相互作用的可能机制并非十分明确，因此有必要在两者之间进行相关研究[4]。

超极化激活电流(If)是重要的起搏调控部分，超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN)家族基因参与编码If电流并参与窦房结细胞自发性舒张期膜去极化过程，HCN4作为HCN基因家族4个亚型之一，与心脏起搏的产生和调节关系密切，所以称为起搏基因[5-6]。本研究从HCN4基因入手研究HF伴风湿性心脏瓣膜病心房颤动与心功能正常的风湿性心脏瓣膜病心房颤动，探讨心功能不全患者发生心房颤动的分子机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2008—2011年新疆医科大学第一附属医院因心脏瓣膜病需接受开胸换瓣手术患者45例，根据其心功能分级，将NYHA分级为Ⅱ～Ⅲ级者27例作为试验组，将心功能正常者18例作为对照组。其中试验组男15例，女12例；平均年龄(48.6±7.3)岁；左心室射血分数为(35.1±5.0)%；NYHA Ⅱ级者11例，Ⅲ级者16例。对照组男7例，女11例；平均年龄(46.7±6.6)岁；左心室射血分数为(51.8±2.9)%。患者术前均经常规检查排除其他导致心房颤动的疾病，且无电解质紊乱和肝肾功能失代偿等。患者均为慢性心房颤动，持续时间≥6个月。本研究患者均知情同意，本研究获本院医学伦理委员会批准。

1.2 标本采集及保存 患者接受开胸换瓣手术过程中，在心脏停搏后获取心耳约200 mg，所取样本快速冷冻在液氮中并于-80 ℃保存。

1.3 实时荧光定量PCR(Real-time PCR) (1)取100 mg左心耳组织，用Trizol(Invitrogen公司)一步法提取总RNA。反转录按照操作说明进行，反应体系如下：在体积为25 μl反转录管中加入2 μg总RNA，5 μl反转录酶M-MLV(美国Promega公司)，5×反应缓冲液5 μl，0.5 μl Oligo(dT)，0.1 mmol/L dNTP，25 μl RNA酶抑制剂，补足RNAase-Free水至25 μl，反应条件为37 ℃ 60 min，95 ℃ 2 min，合成的cDNA置-20 ℃备用。RNA通过分光光度法定量测量，测量波长为260、280 nm,且A260/A280>1.8。(2)引物设计与合成：引物设计见表1，由TaKaRa公司合成。(3)Real-time PCR体系(25 μl)：待测样品cDNA稀释5倍，然后取cDNA 2 μl，SYBR Greenq PCR Master Mix 12.5 μl(上海睿安生物)，上游引物(10 μmol/L)0.5 μl，下游引物(10 μmol/L)0.5 μl，ddH2O 9.5 μl。(4)反应条件：95 ℃预变性2 min，随后进入PCR循环，95 ℃变性10 s，退火温度见表1，退火30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环。反应完成后根据Ct值计算得出目的基因mRNA相对表达量。(5)电泳：取目标基因PCR产物5 μl，用含溴化乙啶的2% 10 g/L的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下进行观察，在BIO-RAD凝胶成像系统上扫描获得目标基因产物的电泳图像，mRNA水平的相对定量通过系统软件使用对照方法(相对表达量=2-ΔΔCt)获得。

表1 基因引物序列、PCR反应条件及产物长度

Table 1 Gene sequences of primers，PCR reaction conditions and length of products

基因引物序列循环数退火温度(℃)产物长度(bp)HCN4F5'-CAAGGATGAGAACACCAC-3'3556198R5'-GAAGATGTAGTCCACGGG-3'β-actinF5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'3560186R5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'

注：HCN4=超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4，β-actin=β-肌动蛋白

1.4 蛋白质免疫印迹法(Western-blotting) 膜蛋白提取按照试剂盒(北京索莱宝)说明操作，总蛋白含量测定按照BCA法。取心房相等量(100 μg)膜蛋白在7.5% SDS-PAGE凝胶(见表2)中被分离转移到PVDF膜。采用单克隆抗-HCN4(Abcam)，β-actin通道蛋白特异性一抗(兔抗IgG，武汉博士德公司)进行杂交，经辣根过氧化物酶(HRP)标记的特异性二抗(山羊抗兔-IgG，武汉博士德公司)孵育1 h，进行DAB显色。免疫反应通过稳定液Western化学发光HRP法检测，使用Image Quant350成像仪和Image Quant TL-1软件进行光密度分析定量。β-actin控制同一蛋白加载和标准化离子通道蛋白条带强度。所有Western-blotting样本杂交信号在BIO-RAD凝胶成像系统进行扫描定量。

表2 SDS-PAGE凝胶配方

注：-表示无此配料

2 结果

2.1 两组HCN4 mRNA水平比较 对照组HCN4 mRNA表达水平为(1.12±0.69)，试验组为(4.91±1.51)。试验组HCN4 mRNA表达水平高于对照组，差异有统计学意义(t=0.021，P<0.05)。

2.2 两组HCN4蛋白表达水平比较 对照组HCN4蛋白表达水平为(1.02±0.15)，试验组为(2.01±0.92)。试验组HCN4蛋白表达水平高于对照组，差异有统计学意义(t=0.031，P<0.001，见图1)。

图1 Western-blotting检测目标基因的蛋白表达

3 讨论

既往研究发现HCN4基因表达增高导致风湿性心脏瓣膜病心房颤动，其发生的机制可能是由于阳离子If增大，由此激发心房肌自发性舒张期膜去极化过程，进而提高心房肌自律性[7]，导致心房颤动[8-9]。

HCN4又被称为起搏基因[5-6]。既往研究相对集中于HCN4与一些心律失常如风湿性心脏病心房颤动等，但是有关比较风湿性心脏病心房颤动与心功能的研究较少，因此本研究进行了有关风湿性心脏瓣膜病心房颤动伴HF和心功能正常的风湿性心脏瓣膜病心房颤动HCN4表达分子机制的研究。HCN通道是心脏窦房结起搏功能重要的分子基础[6]。通常情况下，除起搏细胞外，正常心肌中的HCN通道表达较少，If电流较弱；而在各种病理因素的刺激下，心肌中HCN通道表达异常或结构功能异常，导致If电流增大或减小，最终导致各种心律失常。既往研究发现心房肌If电流增大可能使心房肌细胞具有起搏细胞的特征，因而增加局部心房自律性，使心房有效不应期缩短，易发生房性心律失常[10]。本研究结果显示，HCN4在HF与心功能正常的风湿性心脏瓣膜病心房颤动患者的心房肌中均有表达，故推测风湿性心脏瓣膜病心房颤动患者心房肌异常的自律性可能与HCN4表达有关。本研究结果亦显示，与心功能正常的风湿性心脏瓣膜病心房颤动患者相比，风湿性心脏瓣膜病心房颤动伴HF患者HCN4 mRNA含量及蛋白表达水平均增加，可能因为HF引起的多种钾通道向下调节，间隙连接表达和功能异常产生空间异构性，因此推测风湿性心脏瓣膜病心房颤动伴HF患者显著的房性心律失常可能是由于心房肌中HCN4表达(即起搏电流If)上调，提供了异位起搏点。

综上所述，HCN4在HF与心功能正常的风湿性心脏瓣膜病心房颤动患者的心房肌中均有表达，且随着心功能不全的加重，HCN4表达水平上调。

本文链接：

本文的局限性是未结合离子通道电流进行相关研究，本课题下一步将通过膜片钳技术测定相应的电流，通过对其结构-功能进行研究，从电流改变方面得知HCN4如何影响If通道功能，这将为心律失常的诊断和治疗提供更加详实和全面的理论基础。参考文献

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(本文编辑：贾萌萌)

Expression Level of Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide-gated Channel 4 in Patients With Atrial Fibrillation Associated With Rheumatic Valvular Heart Disease of Different Cardiac Functions

ZHANGJian，LIFa-peng，GANTian-yi，etal.

DepartmentofHeartCenterCCU,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054，China

Objective To investigate the expression level of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 4(HCN4)in the atrial muscle of patients with atrial fibrillation associated with rheumatic valvular heart disease with heart failure or normal cardiac function.Methods We enrolled 45 patients with valvular heart disease who were going to receive thoracotomy for valve replacement in the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University from 2008 to 2011.According to cardiac functional grading，we assigned 27 patients who were at grade Ⅱ-Ⅲ in NYHA grading into trial group and assigned 18 patients with normal cardiac function as control group.Real-time PCR and Western-blotting were employed to determine mRNA level and protein expression level of HCN4 of the two groups.Results The mRNA expression level of HCN4 in control group was(1.12±0.69)，lower than that of trial group which was(4.91±1.51)(t=0.021，P<0.05).The protein expression level of HCN4 was(1.02±0.15)，lower than that of trial group which was(2.01±0.92)(t=0.031，P<0.001).Conclusion There is HCN4 expression in the atrial muscle of patients with atrial fibrillation associated with rheumatic valvular heart disease.With the aggravation of heart failure，the expression level of HCN4 increases.

Rheumatic heart disease；Atrial fibrillation；Cyclic nucleotide-gated cation channels；Heart failure

国家自然科学基金资助项目(81260069)

830054 新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院心脏中心心脏重症监护病区CCU(张健，李发鹏，甘天翊，许国军，周贤惠，李耀东，郭霞)，心脏中心起搏电生理科(汤宝鹏)；新疆维吾尔自治区人民医院(何卫)

汤宝鹏，830054新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院心脏中心起搏电生理科；E-mail：tangbaopeng@hotmail.com

R 541.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.26.011

2014-07-17；

2015-07-13)

注：张健和李发鹏同为第一作者