田云芳,袁秀云，蒋素华，马 杰，苏金乐，崔 波

(1 郑州师范学院 a 生命科学学院，b 生物研究所，河南 郑州 450000；2 河南农业大学 林学院，河南 郑州 450000)

蕙兰CfMADS1基因的克隆及其时空表达特性

田云芳1a，2,袁秀云1b，蒋素华1b，马 杰1b，苏金乐2，崔 波1b

(1 郑州师范学院 a 生命科学学院，b 生物研究所，河南 郑州 450000；2 河南农业大学 林学院，河南 郑州 450000)

【目的】 对蕙兰CfMADS1基因cDNA全长进行克隆和时空表达特性研究，为研究成花相关基因的功能提供参考。【方法】 以蕙兰萼片cDNA为模板，利用反转录RT-PCR和RACE的方法，克隆获得CfMADS1全长cDNA序列，并对其进行生物信息学分析。以蕙兰各时期的器官组织为材料，利用荧光定量PCR进行该基因的时空表达分析。【结果】 成功克隆了CfMADS1基因(GenBank登录号为KC148540)，其cDNA序列全长1 061 bp，开放阅读框长744 bp，编码247个氨基酸，分子式为 C1 244H2 040N370O377S9。其编码的氨基酸序列与AP1/FUL亚家族中金钗石斛MADS1具有较高的同源性 (85.43%)，与AP1/FUL转录因子亚家族中的蛋白聚为一类。该基因编码蛋白没有明显的信号肽和跨膜域，极可能位于细胞核内，具有MADS保守域(1-61aa)和相对保守的K区(87-178aa)，而且在C末端具有AP1/FUL特征基序(LPPWML)，二级结构中α-螺旋所占比例较高 (55.63%)，三级结构与月季、水稻和水仙MADS1蛋白结构非常相似。该基因在盛花期叶中表达最强烈，花蕾期叶、葶、蕾及营养期叶、盛花期葶中表达较为强烈，子房和营养期根中表达较弱，其余器官组织中表达痕量。【结论】 从蕙兰萼片中克隆得到了CfMADS1 cDNA全长序列，CfMADS1与蕙兰的成花诱导、花发育以及果实形成有关。

蕙兰；AP1/FUL-like基因；时空表达

ABCDE花发育模型中大部分基因都属于MADS-box 基因，MADS-box 基因是很大的一个转录因子家族，在真核生物的发育过程中有着重要的作用。MADS-box转录因子中都含有一个大约由60个氨基酸组成的高度保守的结构域(被称作MADS-box 结构域)及I区(不太保守)和大约70个氨基酸残基K区(相对保守)，C末端最不保守[1]。拟南芥中AP1(APETALA1)和FUL(FRUITFULL) 基因是植物特有的MADS-box基因，属于植物花发育基因中的A类基因。AP1和FUL序列具有很高的相似性，属于AP1/FUL基因亚家族。拟南芥中AP1和FUL基因在决定花分生组织方面功能冗余，但AP1基因在决定花萼花瓣形成方面及FUL基因决定果实形成方面功能相互独立。AP1基因作为A类基因决定花萼花瓣形成的功能被认为是十字花科植物所特有的[2]。

AP1/FUL亚家族基因发生多次基因复制事件后，基因功能开始分化。如苹果中AP1-like基因MdMADS5仅在花萼中特异表达，主要参与萼片的形成[3]；罂粟和花菱草的FUL-like基因在侧芽分生组织生长、花分生组织决定、花萼形成和果实发育中都扮演着不同的角色，罂粟FUL-like基因还有调控开花时间和决定花瓣形成的功能[2]。

研究表明，MADS-box基因不仅参与花器官的形成，还与根的发育[4]、花的起始、花分生组织的决定[5]、胚的形成[6]及种子和果实的发育[7-8]有关，甚至某个基因在不同的发育阶段有着不同的功能[9]。Yu等[10]从石斛兰(Dendrobiumgrex)成花转变时期的茎尖分生组织中克隆了3个MADS-box基因DOMADS1(属于AGL2亚家族)、DOMADS2(属于SQUA亚家族)和DOMADS3(属于AGL2亚家族)，其中DOMADS1在花序分生组织和花原基中转录表达，之后定位于所有的花器官中；DOMADS2在整个成花转变过程中表达，后来在蕊柱中表达；DOMADS3在成花转变早期及后期花葶中表达。

蕙兰(Cymbidiumfaberi)，花姿秀丽，香味浓郁，具有很高的观赏价值。蕙兰花发育是由多个调控途径的基因相互协调而控制的，其调控过程极为复杂，因此对蕙兰成花相关基因进行较为全面的深入研究有重要意义。本研究采用RT-PCR和RACE方法，克隆得到蕙兰花发育相关基因CfMADS1的cDNA全长序列，对其进行了相关的生物信息学分析，并通过荧光定量PCR研究了蕙兰CfMADS1开花相关基因的时空表达特性，以期为研究蕙兰成花相关机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

以蕙兰(Cymbidiumfaberi)营养期、花蕾期、盛花期的根、叶、葶、花蕾、花萼、花瓣、唇瓣、蕊柱和子房为材料，样品在液氮中速冻后，置-80 ℃冰箱贮存备用。

1.2 主要试剂与仪器

试剂：Trizol购于Invitrogen公司，RNA反转录试剂盒(TaKaRa Prime ScriptTMRT-PCR Kit)、DNA去除反转录试剂盒、SYBRⅡ荧光定量PCR试剂盒、克隆载体 pMD19-T vector、DNA Marker DL2000、大肠杆菌DH5α感受态细胞均购于TaKaRa生物公司，IPTG、X-gal购于上海生工公司，DNA凝胶回收试剂盒购于天根生物技术公司，其他试剂均为国产分析纯。

仪器：紫外分析仪(北京六一)、高速冷冻离心机(Eppendorf)、梯度PCR仪(Biometra)、凝胶成像系统(Uvitec)、电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒)、制冰机(上海田枫)、微量紫外分光光度计(美国，Quawell Q5000)和荧光定量PCR仪(Eppendorf)。

1.3 RNA提取及反转录

在Trizol方法基础上提取RNA，并加以改进：样品的起始量与提取缓冲液的比例在1∶10(质量体积比)左右；体积分数75%乙醇冲洗2次；-20 ℃异丙醇沉淀RNA 5～10 min、10 000 r/min离心10 min，分别提取蕙兰各器官组织总RNA后，用DEPC水稀释，用核酸蛋白分析仪测定其OD260、OD280值，测定RNA浓度和纯度，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

用M-MLV反转录酶(TaKaRa公司)和DNA去除反转录试剂盒，合成cDNA第一链。反应产物于-20 ℃保存。

1.4 蕙兰CfMADS1全长cDNA的克隆

根据高度保守的区段，利用Primer premier5.0生物软件设计简并引物(表1)AP1 引物对，以蕙兰萼片RNA反转录的cDNA第一链为模板进行PCR扩增。PCR反应体系20 μL：ddH2O 11.7 μL，10×PCR Buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，模板cDNA 1 μL，10 μmol/L上下游特异引物各1 μL，0.5 UTaq酶 0.2 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min，然后以94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s进行35个循环，于72 ℃延伸10 min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。然后进行EB染色20 min，紫外光下将目的条带迅速切下，进行凝胶回收(按照DNA凝胶回收试剂盒说明进行)，最终得到回收产物30 μL，取3 μL检测浓度。取回收产物4 μL克隆到载体pMD19-T上，构建重组质粒(按说明书进行操作)。将重组质粒进行热击(42 ℃)转化感受态细胞大肠杆菌DH5α，涂布于含有Amp、IPTG和X-gal的固体LB培养基上，37 ℃培养箱中倒置暗培养14 h左右，进行重组子筛选后送英骏公司测序。根据已确定的核苷酸序列保守区段，设计合成上下游巢式引物各2个，并与 5′RACE(Clontech)、3′RACE(TaKaRa)试剂盒中的引物相结合，克隆该已知序列的5′和3′端(5′RACE和3′RACE具体步骤按照说明书进行)。PCR产物回收后经pMD19-T载体克隆、英骏公司测序，使用DNAMAN软件与已知序列拼接，获得该基因的cDNA全长序列。

1.5 蕙兰CfMADS1基因的生物信息学分析

利用DNAMAN软件进行核苷酸序列的拼接，分析氨基酸序列同源性，构建系统进化树；利用NCBI寻找开放阅读框，进行BLAST比对，登录至GenBank；利用Primer premier5.0软件进行氨基酸的推断；利用ProtParam进行相对分子量和等电点预测；利用SignalP进行信号肽预测；利用TMHMM进行跨膜域预测；利用PSORT进行亚细胞定位；利用ExPASy进行蛋白质的疏水性分析；利用Scanprosite进行蛋白质结构功能域分析；利用SOPMA、COILS和predictprotein预测编码蛋白的二级结构；用SWISS-MODEL进行三维结构建模。

1.6 蕙兰CfMADS1基因的时空表达特性分析

根据荧光定量引物设计原则，在所克隆的基因序列基础上设计引物，引物序列见表1。

以蕙兰反转录一链cDNA为模板，利用SYBRⅡ荧光定量PCR试剂盒进行RT-PCR，将所得到的条带进行大小比对，回收、纯化、连接，送英骏公司测序。

以UBQ3和ACT作为内参基因，进行各目的基因的表达水平检测。每个器官组织对应的样品设3个重复。利用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。

2 结果与分析

2.1 蕙兰RNA的提取

将所提取的蕙兰各个器官组织样品RNA进行凝胶电泳发现，28S、18S、5S条带均出现，且28S比18S略亮，18S比5S亮，推断所提取的RNA质量较高，比较完整，没有其他杂质，且没有降解。

2.2 蕙兰CfMADS1基因的克隆

以蕙兰萼片RNA反转录的cDNA为模板，以特异引物AP1 Forward和Reverse为引物，进行中间片段的PCR扩增，经凝胶回收、连接、转化、提取质粒、测序，得到1条基因片段，其核苷酸序列大小为376 bp(图1a)。

将所得到的目的基因片段经BLAST同源性比对显示，该片段的核苷酸序列与石斛兰(AF198175、EF535598、AY927236、DQ462469)、蝴蝶兰(JQ065097、DQ104327)AP1/FUL亚家族基因核苷酸序列的同源性均在85%以上，表明已克隆出蕙兰AP1/FUL亚家族基因的部分cDNA序列。

根据该基因的保守区片段序列，设计特异引物AP14ro-315和AP14ri-127及AP14fo-141和AP14fi-291，结合试剂盒中的内外引物进行5′与3′端的巢式PCR扩增，结果表明，5′与3′端分别长265(图1b)和633 bp(图1c)，且均与原始序列有部分重叠。进行序列拼接后，得到该基因的cDNA全长。

2.3 蕙兰CfMADS1基因的序列分析

CfMADS1 cDNA全长1 061 bp，包含1个起始密码子ATG和1个终止密码子TAA，开放阅读框(ORF)长744 bp，编码 247个氨基酸，有1个poly(A)结构尾巴，3′UTR为200 bp，5′UTR为117 bp(图2)。

2.4 蕙兰CfMADS1蛋白的同源性及系统进化分析

对蕙兰CfMADS1编码的氨基酸残基序列进行BLAST比对发现，其与其他植物的AP1/FUL亚家族同源类似物有较高的同源性。用DNAMAN进行多重序列比对表明，M区同源性最高，K区较高，I区不高，C末端变化较大，且该氨基酸序列具有单子叶植物中AP1同源类似物的LPPWML保守基序。蕙兰与其他植物如金钗石斛MADS1(ABQ08573)、朵丽蝶兰MADS1(AFD36437)、蝴蝶兰AP1(AAZ76263)、华山姜APETALA1(ABS83558)、油棕MADS(AAQ03221)、紫六出花APETALA1(BAL70391)的氨基酸序列均有较高的同源性，其中蕙兰与金钗石斛MADS1的同源性最高，达到85.43%(图3)。

在多重比对的基础上，构建CfMADS1与其他植物AP1/FUL亚家族氨基酸序列系统进化树，结果(图4)表明，朵丽蝶兰MADS1和蝴蝶兰AP1聚为一束，金钗石斛MADS1和球花石斛FUL1聚为一束，然后再和石斛兰DOMADS2聚为一束，呈现出一定的的种属特性, CfMADS1属于AP1/FUL亚家族，CfMADS1的进化树分析结果基本符合植物分类学的APG分类系统。

2.5 蕙兰CfMADS1蛋白的生物信息学分析

利用ProtParam预测CfMADS1蛋白的分子式为 C1 244H2 040N370O377S9，分子质量为28.50 ku，理论等电点为9.63，带正电残基(Arg+Lys)32个(占总氨基酸的17.0%)，负电残基(Asp+Glu)30个(占总氨基酸的12.1%)。肽段中有5个半胱氨酸残基，含量较高的依次是亮氨酸(13.4%)、谷氨酸(10.1%)、丝氨酸(10.1%)和赖氨酸(10.1%)，亮氨酸、谷氨酸和丝氨酸的含量与蕙兰CfAP11中的相应氨基酸残基含量(分别为13.2%,9.4%,9.4%)[11]接近。N端为1个蛋氨酸残基。推算其半衰期为30 h，不稳定系数为55.80，脂溶指数为83.00，总平均亲水指数为-0.791，理化参数与CfAP11[11]接近。

信号肽分析表明，CfMADS1没有明显的信号肽，不是分泌性蛋白；利用TMHMM跨膜域分析表明，该蛋白没有明显的跨膜域； PSORT预测结果表明，CfMADS1极可能位于细胞核内(可能性为76.0%)。CfMADS1疏水性最大值为2.089，位于第45个氨基酸残基；最小值为-2.589，位于第141个氨基酸残基，总体来看大部分区域为亲水区，由此推断，CfMADS1可能是不稳定的亲水性蛋白。

SOPMA预测表明，CfMADS1蛋白由55.63%的α螺旋、10.53%的延伸链、32.79%的无规则卷曲和4.05%的β转角构成，α螺旋和无规则卷曲所占比例较高。

在Scanprosite数据库中进行蛋白质结构域分析预测，结果显示，CfMADS1含有高度保守的MADS结构域(1-61aa)和中度保守的K区(88-178aa)。通过SWISS-MODEL在线同源建模进行三级结构预测，发现CfMADS1模型与月季(FJ970028.1)、水稻(AF058698.1)和水仙(JN704304.1)的结构相似度很高。

2.6 蕙兰CfMADS1基因的时空表达特性

本研究以UBQ3、ACT同时为内参基因，利用2-ΔΔCt法对目的基因CfMADS1的相对表达水平进行分析，结果见图5。图5表明，CfMADS1基因在盛花期叶中表达最强烈，花蕾期叶、葶、蕾和营养期叶及盛花期葶中表达较为强烈，子房和营养期根中表达较弱，其余器官组织中表达痕量。

对于根来说，营养期根中表达量高于花蕾期。对于叶来说，从营养期到花蕾期再到盛花期，表达量依次升高。对于花葶来说，花蕾期和盛花期表达量都较高。对于花器官来说，该基因表达微弱。在营养期叶、根和花蕾期叶器官中均有表达，表明该基因与花的诱导和花的起始有关；在花蕾期葶、花蕾中都有较高水平的表达，说明其可能与花器官的发育和花器官的形成有关，也可能是花蕾中该基因的部分mRNA通过花葶运输而进行表达；在盛花期叶中高度表达，葶中表达水平也较高，说明盛花期该基因与前两个时期相比得到了较高水平的表达；盛花期子房中也有一定水平的表达，说明该基因以某种机制参与蕙兰果实的形成，这与CfAP11与蕙兰果实形成关系密切的结果[11]是一致的。

3 讨 论

许多研究表明，AP1-like基因主要参与调控花序分生组织向花分生组织的转变，控制花萼花瓣形成。AP1/FUL-like基因的表达与果实的形成密切相关[12]。本研究发现，蕙兰的AP1-like基因CfMADS1在营养期和花蕾期叶中均有表达，说明具有促进成花转变、提前开花的作用；在花蕾期花葶和花蕾中表达水平较高，说明该基因可能与花器官的发育和形成有关，且可能通过花葶运输到花蕾中部分表达；在盛花期叶和花葶中表达水平较高，子房中也有一定水平的表达，说明该基因可能以某种机制参与果实的发育和形成，且通过叶和花葶向子房中积累，以逐渐形成蕙兰的果实，这与AP1/FUL亚家族基因参与果实的形成密切相关。该结果与苹果MdMADS12在花蕾、未开花时叶、花期叶及营养枝中的表达特性[13]较为相似；而与文心兰OMADS10仅在营养期叶、唇瓣和心皮中表达的结果[14]不一致。

CfMADS1与CfAP11表达特性相似的是，在营养期和花蕾期叶中表达水平均较高，在盛花期的花葶和子房中的表达水平也较高，而在花器官的花萼、花瓣、唇瓣及蕊柱中表达较弱[11]。CfAP11与CfMADS1具有相似的表达特性，可能是二者在蕙兰植株内功能冗余的原因。

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Cloning and spatiotemporal expression ofCfMADS1 gene in orchid (Cymbidiumfaberi)

TIAN Yun-fang1a,2，YUAN Xiu-yun1b，JIANG Su-hua1b，MA Jie1b，SU Jin-le2，CUI Bo1b

(1 aCollegeofLifeScience，bInstituteofBiotechnology,ZhengzhouNormalUniversity,Zhengzhou,Henan450000,China2CollegeofForestry,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan450000,China)

【Objective】 This study cloned a full-lengthAPETALA1/FRUITFULL-like (AP1/FUL-like) MADS box cDNA fromCymbidiumfaberiand analyzed its spatiotemporal expression to provide a reference for studying function of flower related genes.【Method】CfMADS1 gene was isolated from sepals ofC.faberiby RT-PCR and RACE.Then spatiotemporal expression was detected by real time PCR.【Result】CfMADS1 gene was cloned (GenBank number:KC148540).The full length of cDNA sequence is 1 061 bp,with open reading frame of 744 bp,encoding 247 amino acids.The molecular formula is C1 244H2 040N370O377S9.The deduced amino acid sequence ofCfMADS1 shared 85.43% homology with a member of theAP1/FUL-like group of MADS box genes (DendrobiumnobileMADS1).CfMADS1 belonged to theAP1/FULtranscription factor subfamily.The deduced protein has no obvious signal peptide and transmembrane domain,and probably located in the nucleus.It had a MADS domain (1-61aa),a relatively conservative K region(87-178aa)and a C terminal conserved motif LPPWML.The secondary structure of CfMADS1 mainly consisted of alpha helices (55.63%),and the three-dimensional structure of the protein was similar to that of homologues inRozahybrida,OryzasativaandNarcissustazetta.Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) results revealed low levels of its mRNA in ovaries and roots during vegetative period,and in other tissues.Highest levels ofCfMADS1 expression were observed in leaves at full-blossom stage followed by pedicels at reproductive period,leaves at vegetative period,and leaves,pedicels,and buds at bud stage.【Conclusion】 A full-lengthAP1/FUL-like MADS box cDNA was cloned fromC.faberisepals andCfMADS1 involved in floral induction,floral development and fruit formation.

Cymbidiumfaberi;AP1/FUL-like gene;spatiotemporal expression

2014-01-06

河南省科技攻关项目(092102110128)；河南省教育厅科学技术研究重点项目(14A22005)

田云芳(1978-)，女，河南荥阳人，讲师，博士，主要从事园林植物资源与利用研究。E-mail:tianyunfang2011@163.com

时间:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.012

Q786

A

1671-9387(2015)07-0143-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.012.html