王 杰，陈 婷，沈清武

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

KLF15基因表达特征及其腺病毒超表达载体的构建

王 杰，陈 婷，沈清武

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

【目的】 分析锌指蛋白转录因子15( KLF15)在小鼠各组织及C2C12细胞分化过程中的表达情况，构建KLF15的腺病毒超表达载体。【方法】 采集小鼠肝、脾、肾、脂肪、骨骼肌及培养的C2C12成肌细胞，提取不同分化时期(0，2，4 d)的C2C12细胞及不同组织的RNA，检测KLF15的表达情况；过夜连接Hind Ⅲ和XbaⅠ双酶切后的pAdTrack-CMV与KLF15真核表达质粒(pcDNA3.1-KLF15)，获得pAdTrack-KLF15质粒。将该质粒经PmeⅠ线性化后转入BJ5183感受态细胞进行重组，构建pAdEasy-KLF15腺病毒超表达载体。将pAdEasy-KLF15质粒PacⅠ酶切线性化回收后，转染293A细胞进行包装、扩繁和纯化。将获得的KLF15重组腺病毒侵染C2C12细胞，实时荧光定量PCR检测其对KLF15表达的影响。【结果】KLF15在C2C12成肌细胞分化过程中表达显著升高，并在分化后期达最高值；KLF15在肝脏、肾脏和脂肪中的表达水平极显著高于骨骼肌和脾脏。成功获得了pAdEasy-KLF15腺病毒超表达载体，其侵染C2C12细胞后能显著上调KLF15 mRNA的表达水平。【结论】KLF15基因在C2C12成肌细胞中高表达，并成功构建了KLF15重组腺病毒载体。

KLF15；重组腺病毒；C2C12成肌细胞

锌指蛋白转录因子(Kruppel-like factors，KLFs)家族是锌指蛋白超家族中的一员，其通过C端的锌指结构与DNA结合，调控相关基因的表达，在心肌、平滑肌和骨骼肌对细胞的增殖、分化、迁移以及相关疾病的调控中具有重要的作用[1-4]。研究证明，KLFs因子的结构主要分为3部分：其一，KLFs的C端包含3个Cysteine2/Histidine2位点[5-6]；其二，KLFs因子中包含了一个高度保守的区域TGEKP(Y/F)X，该区域也是锌指蛋白所包含的区域[7]；其三，KLFs因子可以与CACCC或GT盒子等一些特定的DNA绑定位点结合来调节DNA的转录[6-7]，对细胞的增殖、分化、迁移都具有重要的作用。1993年，红细胞中第1个KLF因子被鉴定出来并被命名为EKLF/KLF1[8]，其对β-globin基因的活性和表达具有重要的作用[9]。此后，共有17种KLF家族成员被发现，根据这些因子在染色体上的位置而依次命名为KLF1-KLF17，且在不同的细胞类型中会有不同的表达，对细胞的增殖和分化具有重要的作用[10]。

截至目前，已发现有10多种KLFs家族因子在肌肉中表达，但对其大部分的作用机理还不明确。KLF15属于KLF超家族的一员，最早在肾脏中被发现并命名为Kidney-Enriched Kruppel-Like Factor[11]。在骨骼肌中的研究显示，KLF15可通过调节GATA4以及acetylcoenzyme A2的活性来参与骨骼肌的能量代谢[12-13]；同时，KLF15可通过连接成肌因子和D4Z4的启动子来调节面部肌肉萎缩(FSHD)，而超表达Myog可上调KLF15的表达[14]。KLF15可以通过调节mTOR信号通路的活性来影响糖皮质激素受体(GR)的活性[15]，并且KLF15对骨骼肌脂质的流动以及运动后的适应能力也有一定的作用[16]。但是到目前为止，有关KLF15对骨骼肌成肌细胞分化影响的研究还未见报道。

本试验前期研究发现，KLF15在骨骼肌快、慢肌中的表达差异显著，在慢肌中的表达极显著高于快肌，推测其可能在细胞分化过程中具有重要作用。为此，本试验检测了KLF15在小鼠不同组织及C2C12成肌细胞分化中的表达情况，并构建了KLF15重组腺病毒超表达载体，旨在为进一步研究KLF15对活体肌肉发育的作用机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 细胞、载体及试剂 C2C12细胞系、293A细胞系、DH5α感受态细胞及BJ5183感受态细胞由西北农林科技大学脂肪沉积与肌肉发育实验室保存；KLF15真核超表达载体(pcDNA3.1-KLF15，3′端带Flag标签)由Susan J.Gray (University of Massachusetts Medical School)赠送；pAdTrack-CMV载体来自于西北农林科技大学脂肪沉积与肌肉发育实验室；胰酶购于美国GIbco公司；Lipofectamin 2000购于上海Invitrogen公司；限制性内切酶(Hind Ⅲ和XbaⅠ)、Taq酶和T4连接酶、Real-time PCR试剂盒、RNAiso Plus均购于TaKaRa公司；内切酶PmeⅠ和PacⅠ购于New England Biolabs公司；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、马血清(HS)购自Hyclone 公司；质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒购于Omega公司。

1.1.2 试验动物 2月龄小白鼠，购于第四军医大学。

1.2 KLF15在小鼠不同组织及C2C12成肌细胞分化中的表达检测

1.2.1 C2C12成肌细胞的培养及小鼠组织的采集 用增殖培养基(GM，DMEM+体积分数 10% FBS+100 U/mL青链霉素)培养C2C12成肌细胞，培养条件为37 ℃、体积分数 5% CO2，当细胞融合度达到90%时更换为分化培养基(DM，DMEM+体积分数 2% HS+100 U/mL青链霉素)， 进行成肌诱导分化。将试验小鼠脊椎脱臼法处死后，分别提取小鼠肝、脾、肾、脂肪、骨骼肌后放于超低温冰箱中，待研磨后提取RNA进行后续试验。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测 以GAPDH为内参基因，采用实时荧光定量PCR检测KLF15基因的表达情况。根据GenBank中小鼠KLF15和GAPDH序列(GenBank的登录号分别为:NM_023184和AY618199)，采用primer 5.0设计PCR引物，送华大基因公司合成。KLF15引物序列为： F 5′-ACCGAAATGCTCAGTGGGTTACCTA-3′，R 5′-GGAACAGAAGGCTTGCGAGTCA-3′;GA-PDH引物序列为:F 5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT-3′，R 5′-ATGCATTGCTGACAATCTTGAG-3′。

用RNAiso Plus法提取小鼠不同组织及分化0,2,4 d C2C12细胞总RNA，按照TaKaRa反转录试剂盒进行反转，合成cDNA第一链，然后采用IQ5(Bio-Rad公司)实时荧光定量PCR仪检测KLF15基因的表达情况。反应体系为25 μL：SYBR Premix ExTaq(2×)12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。采用两步法程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环。每个样品重复3次，基因的相对表达量采用2-ΔΔct法计算。

1.3 pAdTrack-KLF15载体的构建与鉴定

使用HindⅢ和XbaⅠ分别双酶切pAdTrack-CMV载体和KLF15真核超表达载体pcDNA3.1-KLF15，酶切体系为：质粒5 μL，Hind Ⅲ(10 U/μL)和XbaⅠ(10 U/μL)各0.75 μL，Buffer 2 μL，ddH2O 12.0 μL，37 ℃反应6 h，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳回收目的条带。将回收的KLF15目的基因及双酶切后的pAdTrack-CMV质粒16 ℃连接过夜，连接体系为：pAdTrack-CMV质粒、KLF15目的基因各2.0 μL，T4 连接酶 0.5 μL，10×Buffer 1.0 μL。取5 μL连接产物加入50 μL DH5α感受态细胞中，冰中静置30 min，42 ℃热激90 s，再在冰中放置1 min。加入800 μL的液体LB培养基，37 ℃、170 r/min振荡培养1 h，4 000 r/min离心4 min，取100 μL左右的菌液涂于含有50 μg/μL卡那霉素的LB琼脂培养板上培养16 h，挑取单克隆，提取质粒，用Hind Ⅲ和XbaⅠ双酶切进行鉴定，阳性质粒命名为pAdTrack-KLF15。

1.4 pAdEasy-KLF15腺病毒超表达载体的构建与鉴定

使用PmeⅠ酶切线性化阳性的pAdTrack-KLF15载体，反应体系为：pAdTrack-KLF15质粒10 μL，PmeⅠ(10 U/μL)1.0 μL，Buffer 2.0 μL，BSA 0.2 μL，ddH2O 6.8 μL，37 ℃反应6 h。酶切产物采用乙醇沉淀法纯化。取BJ5183感受态细胞冰上溶解，加入5 μL左右线性化的pAdTrack-KLF15载体，冰中静置30 min，42 ℃热激90 s，再在冰中放置1 min，加入800 μL左右的液体LB培养基，37 ℃ 170 r/min振荡培养1 h，4 000 r/min离心4 min，取100 μL左右的菌液涂于含有50 μg/μL卡那霉素的LB琼脂培养板上培养18 h，挑取单克隆，提取质粒，进行PacⅠ酶切鉴定，阳性质粒命名为pAdEasy-KLF15。

1.5 重组腺病毒pAdEasy-KLF15的包装、浓缩与滴度测定

用2.5 g/L的胰酶消化对数生长期的293A细胞，并接种于10 cm培养皿中，待细胞融合度达到80%～90%时，将pAdEasy-KLF15经PacⅠ 酶切线性化，乙醇沉淀后，用Lipofectamin 2000转染293A细胞进行包装，于转染后2,3,6和7 d取样，观察细胞荧光及病变情况，并于转染后7 d收集细胞毒液，然后再感染293A细胞。将反复扩增后的毒液经氯化铯密度梯度(1.4,1.2 g/mL)离心纯化，即得pAdEasy-KLF15重组腺病毒，于-80 ℃保存。将重组腺病毒按照10倍倍比稀释，即得10-10浓度梯度，分别感染293A细胞，3 d后观察荧光表达情况，计算病毒滴度，病毒滴度=GFP阳性细胞数×病毒稀释倍数/0.01 mL。

1.6 重组腺病毒pAdEasy-KLF15侵染C2C12细胞

培养C2C12成肌细胞，待融合度达到90%后换成分化培养基，并在分化培养基中加入50%的重组腺病毒pAdEasy-KLF15毒液，24 h后第1次观察荧光情况，48 h后第2次观察荧光情况，并收集细胞，鉴定KLF15的表达情况。

1.7 数据统计与分析

试验数据以“平均值±标准差”(mean±S.D.)表示，运用SPSS 13.0统计分析，用t检验(t-test)对不同组之间的差异进行显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 KLF15在小鼠组织及C2C12成肌细胞分化过程中的表达

实时荧光定量PCR结果显示，随着C2C12成肌细胞分化时间的延长，KLF15表达量极显著升高，并在分化的后期达到表达的最高值(图1-A)。KLF15在2月龄左右小鼠各个组织中都有表达，在肝脏、肾脏和脂肪中的表达水平极显著高于骨骼肌和脾脏(图1-B)，这与相关报道[3]相一致。

2.2 pAdTrack-KLF15载体的构建及鉴定

对pcDNA3.1-KLF15载体进行HindⅢ和XbaⅠ双酶切获得KLF15片段，将该片段与同样经Hind Ⅲ和XbaⅠ双酶切的pAdTrack-CMV质粒进行同源重组，得到pAdTrack-KLF15重组质粒。该重组质粒经Hind Ⅲ和XbaⅠ双酶切鉴定，电泳后可见2条片段，大片段为9.2 kb的 pAdTrack，小片段为1 300 bp的KLF15(图2)。回收小片段测序后与GenBank中小鼠的KLF15基因序列进行比对，结果显示，回收片段的序列与GenBank中小鼠的KLF15基因序列完全吻合，证明pAdTrack-KLF15重组质粒构建成功。

2.3 pAdEasy-KLF15腺病毒载体的构建及鉴定

将线性化后的pAdTrack-KLF15质粒与BJ5183感受态细胞进行同源重组，挑选单克隆质粒，经PacⅠ酶切后，释放1个大小为3 kb的片段(图3)，表明pAdEasy-KLF15构建成功。

2.4 pAdEasy-KLF15腺病毒载体的包装及扩繁

将PacⅠ酶切线性化后的pAdEasy-KLF15转染293A细胞，转染后2 d腺病毒开始扩繁并表达GFP产生荧光(图4-A)；3 d后病毒颗粒开始释放，感染周围的细胞(图4-B)；6 d后出现病毒包装过程中典型的“彗星尾”现象(图4-C)；7 d后荧光表达增多，整个视野的荧光水平显著升高(图4-D)，有70%的细胞表达荧光。收集细胞毒液，反复扩增和纯化，滴度可达到7×10-10PFU/mL。

2.5 pAdEasy-KLF15感染C2C12细胞后对KLF15表达的影响

重组腺病毒感染C2C12细胞2 d后，约有60%的细胞被腺病毒感染并产生荧光 (图5)。收集细胞，提取RNA，实时荧光定量PCR检测KLF15 mRNA的表达水平，结果见图6。

图6显示，与对照相比，KLF15 mRNA的表达水平增加了约100倍。说明KLF15的重组腺病毒表达载体可以显著提高KLF15基因mRNA的表达水平。

3 讨 论

KLF15作为KLF家族的一员，在心肌中可以抑制心肌肥大，在平滑肌中可以抑制平滑肌细胞的迁移。在心肌中，KLF15可以通过抑制GATA4和MEF2A的活性来调节心肌细胞的增殖和分化，超表达KLF15的小鼠患心肌肥大的可能性会显著下降[17]。相关报道称，KLF15对平滑肌的分化有抑制作用，在正常的血管平滑肌中KLF15的表达量很高，但是当血管内皮破损后，KLF15的表达量会显著下降，而超表达KLF15的平滑肌细胞的再生能力会有所下降，并且向受伤部位迁移的能力也明显降低[18]。KLF15对骨骼肌的能量代谢也起到重要的调节作用[16]。上述结果表明，KLF15在肌肉的发育过程中具有重要的作用。

本试验研究显示，KLF15在C2C12成肌细胞分化过程中表达显著升高，并在分化的后期达到最高值，而且在肌肉组织中的表达水平也较高，这与相关报道[15]相一致。同时，前期研究发现KLF15在慢肌肌肉中的表达量极显著高于快肌，推测其可能对骨骼肌的形成，特别是对快慢肌的形成具有重要的作用。

腺病毒具有包装简单，可反复扩繁以及毒力稳定等优势，为了进一步验证KLF15在原代细胞系和活体中对成肌过程的作用机理，同时为了避免真核表达质粒对原代细胞转染率低的局限性[19]，本试验通过酶切已知载体得到了外源目的基因，成功构建了穿梭载体pAdTrack-KLF15，通过同源重组，将外源目的基因KLF15整合到腺病毒骨架载体中，得到了pAdEasy-KLF15，并于包装后感染C2C12细胞；实时荧光定量PCR结果显示，pAdEasy-KLF15可以极显著上调KLF15 mRNA的表达水平，为后续研究KLF15在原代成肌细胞和活体中的作用机理奠定了基础。

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Expression characteristics ofKLF15 gene and construction of its adenovirus vector

WANG Jie,CHEN Ting,SHEN Qing-wu

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The aims of this study were to explore the expression ofKLF15 gene in tissues and differentiation of C2C12 cell of mice and conduct its adenovirus vector.【Method】 Firstly,tissues of mice and C2C12 cells in different differentiation phases were collected to extract RNA for detecting expression ofKLF15 gene.Secondly,the target fragment obtained from pcDNA3.1-KLF15 vector was connected to pAdTrack-CMV after being digested byHindⅢ andXbaⅠto obtain pAdTrack-KLF15 vector.The pAdTrack-KLF15 vector was linearized byPmeⅠ and transformed into BJ5183 competent cells with pAdEasy to construct pAdEasy-KLF15.After the pAdEasy-KLF15 vector was digested byPacⅠ,the purified product was transfected into 293A cells using lip for viral packaging.Finally,q-PCR was used to detect the expression ofKLF15 mRNA after pAdEasy-KLF15 vector was injected into C2C12 cells for 48 h.【Result】KLF15 showed significantly increasing expression during differentiation of C2C12 myoblasts andKLF15 expression levels in liver,kidney and fat were significantly higher than in the skeletal muscle and spleen.The recombinant adenovirus vector pAdEasy-KLF15 was successfully obtained,and the mRNA expression ofKLF15 gene indicated an observably up-regulated trend after it was transfected C2C12 cells.【Conclusion】KLF15 gene showed high expression in C2C12 cells.The recombinant adenovirus vector expressing mouseKLF15 gene was successfully constructed.

KLF15；recombinant adenovirus；C2C12 myoblasts

2014-01-10

西北农林科技大学引进人才科研启动经费项目(Z111021006)

王 杰(1988-)，男，河南信阳人，在读硕士，主要从事动物骨骼肌发育研究。

沈清武(1973-)，男，湖南沅陵人，教授，博士生导师，主要从事肌肉干细胞生物学研究。

时间:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.029

Q782

A

1671-9387(2015)07-0035-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.029.html