梅毒血清固定患者外周血CD4+CD25+Treg和CD4+CD25+Foxp3+Treg的表达及意义

2015-02-22方锐华吴爱武许志萍

现代中西医结合杂志 2015年34期

关键词：调节性梅毒外周血

方锐华，吴爱武，莫友，李群，许志萍

(1. 广州医科大学附属广州第一人民医院，广东广州 510180；2. 广州医科大学，广东广州 510180)

梅毒血清固定患者外周血CD4+CD25+Treg和CD4+CD25+Foxp3+Treg的表达及意义

方锐华1，吴爱武2，莫友1，李群1，许志萍1

(1. 广州医科大学附属广州第一人民医院，广东广州 510180；2. 广州医科大学，广东广州 510180)

目的检测并比较梅毒血清固定患者与治疗后快速血浆反应素环状卡生试验(RPR)转阴患者外周血CD4+CD25+Treg以及CD4+CD25+Foxp3+Treg的表达情况。方法运用流式细胞术检测40例梅毒血清固定患者(实验组)和40例治疗后RPR转阴的梅毒患者(对照组)外周血CD4+CD25+Treg和CD4+CD25+Foxp3+Treg的表达水平并进行比较。结果实验组患者外周血CD4+CD25+Treg细胞占外周血CD4+T细胞总数的(11.90±0.64)%，对照组为(9.09±0.28)%，2组比较差异有统计学意义(t=4.01，P<0.001)；实验组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占外周血CD4+T细胞总数的(6.25±0.28)%，对照组为(3.37±0.24)%，2组比较差异有统计学意义(t=7.90，P<0.001)。结论血清固定梅毒患者外周血中抑制性CD4+CD25+Treg细胞的比例明显高于RPR转阴梅毒患者，且其中大部分为具有抑制活性的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞亚群，推测这类Treg细胞在CD4+T细胞中所占的比例增加与梅毒患者血清固定有一定关系。

梅毒；血清固定；调节性T细胞；流式细胞术

梅毒是由梅毒螺旋体(treponema pallidum，Tp)感染引起的一种常见的性传播疾病，主要通过直接、间接性接触和血液传播[1]。梅毒的发病机制复杂，且近年来的统计数据显示越来越多的患者出现治疗后非梅毒螺旋体抗原血清试验不转阴的现象，即血清固定。发生血清固定的确切原因尚不明确，目前认为，梅毒血清固定可能与Tp感染后患者机体免疫系统出现紊乱从而引起免疫耐受相关，而调节性T细胞(Treg)对细胞免疫应答的抑制可能在其中发挥重要的作用[2]，然而其具体原因及机制至今尚未明确。本实验通过检测并比较梅毒血清固定患者与治疗后RPR转阴患者外周血CD4+CD25+Treg以及CD4+CD25+Foxp3+Treg的表达情况，以探究它们是否与梅毒血清固定的发生存在免疫相关。

1 临床资料

1.1一般资料选择2009—2013年在广州第一人民医院皮肤性病科门诊部与住院部经正规驱梅治疗后出现梅毒血清固定的患者40例作为实验组，其中男21例，女19例;年龄24～46(34.1±2.3)岁;10例为曾经出现过皮肤和/或黏膜损伤的早期梅毒者(包括一期梅毒3例，二期梅毒7例)，30例为从未出现过皮肤和/或黏膜损害的早期潜伏梅毒者。患者经正规驱梅治疗前后其血清中的梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)与快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)均为阳性，且随访期间血清RPR滴度均不转阴，最后一次随访其RPR滴度有1例为1∶8，2例为1∶4，17例为1∶2，20例为1∶1。选取经正规驱梅治疗后血清RPR转为阴性的40例梅毒患者作为对照组，其中男24例，女16例;年龄21～45(33.0±3.0)岁;治疗前确诊为一期梅毒者12例，二期梅毒者18例，早期潜伏梅毒者10例。2组患者的年龄、性别等一般情况比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2标本准备分别抽取2组患者的外周静脉血2 mL，采用EDTA作抗凝处理，保存于温度为4 ℃的冰箱，用于外周血单个核细胞(PBMCs)的分离及流式细胞术(flow cytometry， FCM)检测，于24 h内送检。

1.3主要试剂与仪器流式细胞仪(FACS Calibur型，Becton Dickinson公司，美国)，JY-B快速漩涡混匀仪，小型台式高速离心机，水平离心机等；磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)，大鼠血清，胎牛血清(FBS)，PE标记的鼠抗人CD4单克隆抗体，FITC标记的鼠抗人CD25单克隆抗体， PE标记鼠抗人IgG2b同型抗体，RP-MI1640 细胞培养液，Ficoll 分离液(以上试剂均为Becton Dickinson公司，美国)；FOXP3固定/破膜液缓冲系统(eBioscience公司，美国)，PE标记的鼠抗人Foxp3单克隆抗体(eBioscience公司，美国)。

1.4实验步骤将EDTA抗凝静脉血经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞(PBMC)，调整浓度为2×106/mL。取PBMC悬液各100 mL分别置于实验管和对照管，每管分别加入抗人PE-CD4单抗和抗人PITC-CD25单抗各20 μL，充分混匀后于室温下避光孵育30 min，进行细胞表面抗原染色。然后每管加入新配的固定破膜液2 mL混匀，室温下避光孵育30 min，再用2 mL破膜液洗涤细胞2次后行胞内细胞因子染色。两管均用鼠血清2 mL封闭10 min后实验管加入PE标记的Foxp3单克隆抗体20 mL，对照管加入PE标记的鼠PE-IgG2b 10 μL，室温下避光孵育30 min。再用PBS破膜液洗涤细胞2次后，用300 mL流式染色缓冲液重悬细胞，上流式细胞仪检测，用FACS软件进行分析。

2 结果

实验组患者外周血CD4+CD25+Treg细胞占外周血CD4+T细胞总数的(11.90±0.64)%，对照组为(9.09±0.28)%，2组比较差异有统计学意义(t=4.01，P<0.01)；实验组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占外周血CD4+T细胞总数的(6.25±0.28)%，对照组为(3.37±0.24)%，2组比较差异有统计学意义(t=7.90，P<0.001)。

3 讨论

梅毒是由Tp感染引起的一种临床常见的、慢性、传染性疾病。它的传染性较强，性接触是最主要的传播方式，此外也可通过输血、产道、胎盘、共用注射器、器官移植等多种方式传播。梅毒的临床表现多种多样，机制十分复杂，并可能对患者甚至其下一代的身心健康造成严重的影响[3]。大量流行病学调查数据显示，近年来梅毒发病率呈逐年上升趋势，并且更广泛地分布于发展中国家，我国及全球梅毒发病率均在不断上升，其中男同性恋患者也明显增多，潜伏梅毒和胎传梅毒报告数也明显增多[4]，且越来越多的患者虽然经正规驱梅治疗后仍出现了血清固定现象。然而，引起血清固定的原因及其机制仍未完全明确，是悬而未决的医学难题之一，同时也是临床治疗的阻碍。

目前，医学界普遍认为：梅毒螺旋体感染后所刺激的体液免疫保护性是非常有限的，细胞免疫的作用更为重要，而梅毒血清固定的发生则可能与患者的细胞免疫功能受到抑制相关。国内外对梅毒血清固定的研究主要着眼于细胞免疫的紊乱。细胞免疫被认为是清除体内Tp的主要方式，其中又以T细胞介导的细胞免疫为主。 Fitzgerald[5]提出一期梅毒为Thl细胞占优势而二期梅毒因细胞免疫功能受到抑制转化为Th2细胞占优势的“Thl/Th2漂移”假说。国内也有学者认为梅毒患者Th1和Th2免疫细胞确实存在漂移现象[6]。正常机体内Th1/Th2细胞网络间维持着一定的动态平衡，但是在血清固定梅毒患者中CD4+T细胞明显下降，而且以Th1细胞的减少为主，使Th1/Th2的这种动态平衡向Th2方向漂移。Th2细胞可阻遏由Th1介导的细胞免疫应答，还可抑制INF-γ的产生，从而抑制巨噬细胞活化，并进一步导致IL-2、IL-6分泌水平紊乱，使得机体保护性清除Tp的细胞免疫功能明显下降，同时细胞免疫抑制作用也相对增强。梅毒血清固定患者多数临床症状比较隐匿，这可能与感染初期CD4+T淋巴细胞的Th1亚群及杀伤细胞相对减少、机体免疫反应较迟钝有关。Thl/Th2漂移假说是目前梅毒免疫学中关于细胞免疫的主要学说，它不仅仅是Tp能够逃避机体的免疫监视得以继续增殖、疾病进入潜伏阶段的可能原因，同时也提示梅毒患者免疫功能的紊乱可能与发生血清固定相关。然而，机体Thl/Th2细胞的失衡又与Treg细胞的数量及功能密切相关[5]。赵建斌等[9]研究结果显示：梅毒一期、二期及潜伏梅毒患者外周血Treg细胞比例和正常人相比差异无统计学意义，但是梅毒血清固定阳性患者的Treg细胞比例要明显高于正常健康人群，并且不同组之间差异有统计学意义。也就是说，当感染Tp后，患者外周血中Treg细胞的比例异常增高的，提示患者自身细胞免疫功能会受到严重抑制，通过人体自身免疫并不能将病原体彻底清除。即使经过规范的抗生素驱梅治疗，体内仍然有少量的Tp持续存在，刺激机体持续产生抗体，从而导致血清固定现象的发生。所以，可初步推测Treg细胞在梅毒血清固定的发生中可能起着一定的作用，但是目前仍不能就此下定论。故而，本研究以此为出发点，初步探讨了梅毒血清固定的发生是否与调节性T细胞的免疫抑制功能存在明确的相关性。

迄今为止，Treg也是研究最为深入、被认为是发挥免疫抑制作用的最主要的一类调节性细胞，它能有效抑制效应性T细胞的增殖及其功能的发挥，从而减弱效应性T细胞对病原体的有效应答与清除，促进多种慢性传染病的进一步发展，并与慢性炎症的持续存在相关。因此，Treg细胞被认为在感染相关性疾病，尤其是慢性感染性疾病中起重要作用。梅毒也是一种慢性、常见的感染性疾病，Treg细胞在梅毒血清固定中可能同样起重要的作用。Treg细胞主要包括以下四大类细胞：分别为CD4+Treg、CD8+Treg、NKT (自然杀伤性T细胞) Treg、DN (双阴性) Treg细胞等，其中又以CD4+Treg细胞为主，它在T淋巴细胞的增殖及其功能发挥过程中起重要的抑制性调控作用。

CD4+Treg细胞的表面主要表达CD25、细胞毒性T细胞相关抗原4(CTLA-4)、糖皮质激素诱导的TNFR基因(GITR)等，这些分子一度被当作Treg细胞的常用标记，但后来有学者发现CD25、CTLA-4、GITR等分子同时也可以在其他活化的效应性淋巴细胞上表达，所以它们仍相对缺乏特异性。Foxp3(叉头/翼状家族螺旋转录因子)具有较高特异性的形态与功能性的标记，是调节性T细胞核内的特异性转录因子，其蛋白表达影响着Treg细胞的成熟发育及其抑制功能的发挥。Foxp3主要表达在CD4+T细胞上，而且几乎全部表达于CD25高表达的T细胞中。故而，目前认为具有真正意义上免疫抑制活性的Treg细胞群为CD4+CD25+Foxp3+Treg。

CD4+CD25+Treg可通过分泌抑制性细胞因子IL-10和转化生长因子-β(TGF-β)，干扰树突状细胞对抗原的呈递功能，直接或间接降低抗原特异性T细胞的增殖，抑制一系列炎性细胞因子的产生，因而CD4+CD25+Treg在维持机体免疫耐受和免疫应答稳态方面具有非常重要的作用。近年来，人们对于CD4+CD25+Treg细胞在肿瘤、梅毒、麻风等方面的作用均进行了大量研究，相关的研究结果显示在梅毒、银屑病、麻风、宫颈癌、乳腺癌等患者的外周血中或肿瘤局部CD4+CD25+Treg细胞的水平相对升高，提示在这些患者中异常高水平的CD4+CD25+Treg细胞可能通过抑制机体的正常免疫应答而导致免疫耐受的出现，最终参与疾病的发生、发展及复发[10-15]。

因此，本研究拟通过检测并比较临床梅毒血清固定患者及治疗后RPR转阴梅毒患者的外周血中CD4+CD25+Treg细胞与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞总数的百分比，初步探讨了Treg细胞与梅毒血清固定之间的免疫相关性，以期为血清固定的早诊断、早预防以及早治疗提供新的思路和方法。

本实验以临床就诊的梅毒血清固定患者为研究对象，抽取外周血后采用Ficoll密度梯度离心法分选出PBMCs，提高了Treg在待测单细胞悬液中的百分比，从而排除了外周血中比例较大的中性粒细胞、红细胞等细胞成分对淋巴细胞亚群检出率的影响。在正常人的外周血中，CD4+CD25+Treg约占CD4+T细胞总数的5%～10%，其中又以CD4+CD25+Foxp3+Treg占多数。本研究结果显示，梅毒血清固定患者的外周血CD4+CD25+Treg细胞比例相较于梅毒治疗后RPR转阴者要高，说明梅毒患者血清固定时Treg细胞是升高的，而其中真正发挥有效抑制作用的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞也相应增多,与国内报道的一致[8]。由此可见，CD4+CD25+Treg及CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在梅毒血清固定患者的外周血中是明显升高的，且升高的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞可能通过分泌抑制性细胞因子对Tp特异性的T细胞免疫发挥了抑制作用，进而参与了梅毒血清固定的产生。

综上所述，梅毒血清固定患者外周血中抑制性CD4+CD25+Treg细胞，尤其是CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞亚群的比例明显高于RPR转阴梅毒患者，通过调节CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的抑制活性，有望提高梅毒患者治疗后阴转率，这也许是今后梅毒血清固定免疫学治疗中的一个新手段。

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[10] 张明海,赵建斌. 梅毒血清固定患者CD4+CD25+Treg细胞和CD4+CD25HighTreg细胞功能的差异探讨[J]. 中国皮肤性病学杂志,2013,13(4):334-336

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