王东胜，薛泉宏，高 卉，张俊会，马 鑫，陈姣姣

(1 西北农林科技大学 资源环境学院，陕西 杨凌 712100；2 山西师范大学 生命科学学院，山西 临汾 041004)

CaCl2对低钙土壤中可培养放线菌数量及种类的影响

王东胜1，2，薛泉宏1，高 卉1，张俊会1，马 鑫1，陈姣姣1

(1 西北农林科技大学 资源环境学院，陕西 杨凌 712100；2 山西师范大学 生命科学学院，山西 临汾 041004)

【目的】 分析CaCl2对碳酸钙含量较低土壤中可培养放线菌数量及种类的影响，探索建立新的放线菌分离方法。【方法】 以海拔高度及碳酸钙含量不同的秦岭太白山北坡山地土壤为材料，通过稀释平皿涂抹法分离放线菌，研究了高氏1号培养基中加入CaCl2后低钙土壤中可培养放线菌数量及种类的变化，并用菌落形态特征和16S rDNA序列鉴定新出现的放线菌。【结果】 向高氏1号培养基中加入CaCl2后，供试低钙土壤样品中可培养放线菌总数及链霉菌数量减少，同时所有供试土壤样品中均有部分在高氏1号培养基上生长的放线菌种类消失；供试土壤中有90种新出现的放线菌种类，从中获得了29株代表性菌株。根据菌落形态特征及16S rDNA序列鉴定可知，新出现的29株放线菌主要为链霉菌属和小单孢菌属，其中65.5%具有生物活性及其他应用价值。【结论】 向高氏1号培养基中加入CaCl2，可从低钙土壤中分离到一些新的放线菌，其中有较多的活性物质产生菌。

CaCl2；山地土壤；放线菌分离；高氏1号培养基

放线菌是一类具有广泛实际用途的生物资源，能产生多种具有各种生物活性的代谢产物。从自然界发现和筛选新的活性物质产生菌是新药研制的关键性基础工作，但长期的分离筛选使自然界中未知的新活性物质产生菌愈来愈少，利用传统方法获得新的放线菌及新的活性物质已经变得越来越难。改变分离方法是获得新放线菌及新活性物质的有效途径之一，其中改变培养基成分会获得具有不同营养及生理特性的新放线菌。钙离子是生物体的必需元素，参与细胞的多种生理活动，对维持细胞各种代谢过程极为重要，是各种生物体中最为普遍的第二信使之一[1]。在原核细胞中，钙离子与许多生理生化反应相关，包括细胞分化、致病性、趋化性、细胞膜的形成以及渗透阻力等[2]。研究发现，加入碳酸钙对土壤样品进行预处理，可以增加酸性土壤中可培养放线菌的数量，或可以分离到特殊的放线菌[3-5]。Jensen[3]研究发现，在酸性土壤中加入碳酸钙可以使土壤放线菌数量显著增加。Otoguro等[4]利用碳酸钙对39个土样和植物样进行富集培养，结果分离到了动孢放线菌属放线菌。Uzel等[5]用10 g/L的碳酸钙在100 ℃下对温泉土壤处理1 h后，选择性地分离到了许多高温放线菌。另有研究发现，向培养基中加入CaCl2可以促进Actinobisporayunnanensis气生菌丝的生长[6]，或增加碳酸钙含量较高土壤中可培养放线菌数量及广谱高效拮抗放线菌的种类[7]。但目前尚不清楚向培养基中加入CaCl2对低钙土壤中放线菌数量及种类有何影响。为此，本试验以秦岭太白山不同海拔高度碳酸钙含量较低的山地土壤为材料，分析了高氏1号培养基中加入CaCl2对山地土壤可培养放线菌数量及种类的影响，旨在探索利用改变培养基成分分离新放线菌资源及活性物质产生菌的可行性。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 土壤样品 10种供试土壤采自秦岭太白山北坡(33°57′～34°58′ N，107°45′～107°53′ E，海拔800～3 670 m)，土壤类型分别属于山地淋溶褐土、山地棕壤和亚高山草甸土。供试土壤基本性质见表1。

1.1.2 培养基 主要培养基有高氏1号培养基[8]、高氏1号加钙培养基[7](高氏1号培养基中加入5 g/L CaCl2)。

1.2 方 法

1.2.1 放线菌的分离及数量测定 采用稀释平皿涂抹法[8]。分别称取10.0 g供试土壤加入装有90.0 mL无菌水的三角瓶中，120 r/min振荡30 min进行10-1稀释，依次吸取1.0 mL加入9.0 mL无菌水中做10-2～10-5稀释。分别吸取0.05 mL 10-3，10-4和10-53个稀释度的样品悬液涂布于高氏1号培养基及高氏1号加钙培养基上，28 ℃培养15 d后进行测定。

统计各供试土样中的放线菌总数、链霉菌数量、放线菌种类数(将培养皿中菌落形态有明显差异的菌落视为不同种类)，以及高氏1号加钙培养基中新出现与消失的放线菌种类数。其中可培养放线菌总数根据培养皿中所有放线菌的菌落数计算；链霉菌数量按培养皿中菌落形态可以确定为链霉菌的菌落数计算；新出现放线菌是指不能在高氏1号培养基上生长而只在高氏1号加钙培养基上生长的放线菌；消失放线菌是指只在高氏1号培养基上生长而在高氏1号加钙培养基上不能生长的放线菌。

1.2.2 新出现放线菌的分类鉴定 对供试土样在高氏1号加钙培养基上分离到的新出现的放线菌，按形态特征异同进行归类分组，然后从每组中选取1株作为代表菌株进行16S rDNA序列测定，最后通过形态观察与16S rDNA序列测定相结合的方法鉴定菌种。

(1)菌落形态特征观察。采用划线法[8]，将放线菌在高氏1号培养基平板上划出单菌落，28 ℃培养7 d后，观察放线菌菌落气生菌丝、基内菌丝的颜色，是否产生可溶性色素及是否形成孢子丝等。

(2)16S rDNA序列测定。采用酶解法提取放线菌总DNA，采用细菌16S rDNA通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′进行PCR扩增。PCR反应体系(50 μL)为：超纯水37.7 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 4.0 μL，引物各1.0 μL，Mg2+2.5 μL，Taq酶0.3 μL，DNA模板1.0 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，57 ℃退火55 s，72 ℃延长2 min，30个循环；72 ℃延长10 min，4 ℃保存。扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序。所得序列(GenBank序列号KF317972～KF318000)利用Blastn(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与GenBank数据库中的序列进行比对，获得最相近菌株的16S rDNA序列，采用MEGA 4.0软件按照最大同源性原则进行排序，Neighbor-joining 法构建系统发育树，用自举法(bootstrap)对系统发育树进行检验，重复1 000 次。

1.2.3 CaCl2效应 将CaCl2加入髙氏1号培养基后引起的放线菌数量及种类的变化称为CaCl2效应(Effect of CaCl2)，分别用ECa、ΔECa表示，其计算公式为：

式中：GCa及G分别表示高氏1号加钙培养基及高氏1号培养基中放线菌的数量(CFU/g)或种类数。

1.3 数据处理

采用SAS 9.0软件对所得试验数据进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 CaCl2对土壤可培养放线菌和链霉菌数量的影响

CaCl2对土壤可培养放线菌总数和链霉菌数量的影响见表2。

注：“*”表示2种培养基上可培养放线菌总数及链霉菌数量的差异达到了显著水平(P<0.05)。

Note:“*” stands for significant (P<0.05) difference in culturable actinomycete and streptomycete counts between two tested media.

从表2可以看出，向高氏1号培养基中加CaCl2可减少供试土壤中可培养放线菌总数及链霉菌数量，10种土壤的放线菌总数减少了8.9%～70.1%，其中2、3、5、8、9号土样的放线菌总数在2种培养基中的差异达到了显著水平(P<0.05)；10种土壤的链霉菌数量减少12.5%～79.0%，其中1、3、7、9、10号土样的链霉菌数量在2种培养基中的差异达到了显著水平(P<0.05)。在高氏1号加钙培养基培养条件下，除上述土样以外其余土样中的放线菌总数或链霉菌数量均有所减少，但与高氏1号培养基相比差异均未达到显著水平(P>0.05)。

2.2 CaCl2对土壤放线菌种类的影响

从表3可以看出，高氏1号培养基中加入CaCl2后，对10种土壤可培养放线菌的种类均有一定影响。在高氏1号加钙培养基上，从1、2、3、8、10号5个供试土壤分离到的放线菌种类较高氏1号培养基减少了1～9种，从4、6、7、9号4个供试土壤分离到的放线菌种类较高氏1号培养基增加了1～6种。

从表3还可以看出，向高氏1号培养基中加CaCl2后，10种供试土壤中新出现了6～16种(合并共90种)在高氏1号培养基上不生长的放线菌，同时有3～20种可在高氏1号培养基上生长的放线菌消失。以上结果表明，向高氏1号培养基中加入CaCl2可以激活某些在高氏1号培养基上不生长的放线菌孢子，获得某些在高氏1号培养基上不生长的新放线菌种类，同时也会抑制一些放线菌种类的孢子萌发及生长，使其消失，但其机理尚不清楚。

2.3 加入CaCl2后土壤新出现放线菌种类的鉴定

本研究对获得的90种新出现放线菌，按其形态特征异同进行归类、分组后共得到29组，从每组中选取1株作为代表菌株，对这29株新出现放线菌的菌落形态特征和16S rDNA序列进行鉴定和分析，结果见表4和表5。

注：“+”表示形成孢子丝；“-”表示不产色素或不形成孢子丝。

Note:“+” represents forming spore chain;“-” represents no spore chains or pigment.

注：“-”表示无生物活性。

Note:“-” represents no bioactivity.

从表5可以看出，在加入CaCl2后新出现且已鉴定的29株放线菌中，75.9%为链霉菌属(Streptomyces)，17.2%为小单孢菌属(Micromonospora)，其余为链孢囊菌(Streptosporangium)及野野村菌(Nonomuraea)。图1为22株链霉菌属放线菌的系统进化树，图2为7株非链霉菌属放线菌的系统进化树。此外，在已鉴定的29株放线菌中，有19株有抗菌或其他生物活性[8-16]，占已鉴定菌株的65.5%(表5)。以上结果表明，向高氏1号培养基中加CaCl2，有利于从低钙土壤中分离到新的链霉菌属及小单孢菌属放线菌，其中大部分菌株具有生物活性物质合成功能及应用价值。

2.4 加入CaCl2后放线菌数量、种类变化与土壤性质及海拔的关系

从表2和表3可知，向高氏1号培养基中加入CaCl2后，10种供试土壤中放线菌总数及种类变化各不相同。对加入CaCl2后的放线菌数量和种类变化与土壤性质及土壤所处海拔的相关性进行分析，结果见表6。从表6可知，放线菌总数减少幅度与海拔显著相关，相关系数为-0.730；链霉菌数量减少幅度与海拔、土壤pH及碳酸钙含量极显著或显著相关，相关系数分别为-0.862，0.760及0.738；放线菌种类数变化与土壤pH、碳酸钙含量极显著或显著相关，相关系数分别为-0.870，-0.727。

注：“*”、“**”分别表示相关性达到显著水平(P<0.05)或极显著水平(P<0.01)。

Note:“*”,“**” indicate significant difference atP<0.05 andP<0.01,respectively.

3 结论与讨论

关于钙对放线菌分离效果的影响，已有研究均采用碳酸钙预处理土壤的方法来分离放线菌[3-5]，而将CaCl2加入培养基对放线菌进行分离的研究很少，如Suzuki等[6]研究了培养基中加入CaCl2对放线菌菌丝生长的影响，薛清等[7]研究了培养基中加入CaCl2对高碳酸钙含量土壤放线菌分离效果的影响，但培养基中加入CaCl2对低碳酸钙含量土壤放线菌的分离有何影响尚无报道。本研究发现，向高氏1号培养基中加入CaCl2后，虽然减少了低钙土壤中可培养放线菌的数量及种类，但可以激活某些放线菌的孢子，获得了一些在高氏1号培养基上不能生长的新链霉菌及小单孢菌，其中包括较多的可用于新医药及新农药开发的活性物质产生菌。由此可以推测，改变培养基中某种与微生物生长代谢相关的无机成分，就可以改变土壤中可培养放线菌的数量及种类，获得新的放线菌种类及活性物质产生菌，该结果将为放线菌这一特殊自然资源的深度开发利用提供新的途径。但值得注意的是，采用此方法对放线菌进行分离时，可能会抑制一些放线菌生长，对此效果也要重视。

本研究结果表明，向高氏1号培养基中加入CaCl2后，对碳酸钙含量不同土壤放线菌分离的效果影响不同。因此，在使用该方法时，应根据研究目的和土壤碳酸钙含量来决定是否需要加入CaCl2。若供试土壤碳酸钙含量很低，研究目的是获得尽可能多的放线菌及了解土壤放线菌的多样性，则不必在高氏1号常规培养基中加CaCl2；当研究目的是为了获得新的放线菌种类，开发土壤中未知的放线菌资源，则可在高氏1号培养基中加CaCl2；若供试土壤碳酸钙含量较高，在高氏1号培养基中加CaCl2则有利于增加可培养放线菌数量和种类，并可以促进土壤中具有广谱抗菌活性放线菌资源的开发[7]。

关于CaCl2对放线菌分离效果的影响机理，目前尚不清楚。有研究表明，培养基中一定浓度的Ca2+可以促进或抑制部分放线菌气生菌丝的形成和生长[17]，因此初步推断向培养基中加入Ca2+时，可能使放线菌孢子内某些酶的活性或生化反应受到影响，从而激活放线菌孢子，使原来不能萌发的孢子萌发，最终出现了新的种类；同时也可能阻止了某些放线菌孢子的萌发及生长，而使一些放线菌种类消失，但该推测尚有待进一步研究。

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Effect of CaCl2on number and type of culturable actinomycete in low calcium soils

WANG Dong-sheng1,2,XUE Quan-hong1,GAO Hui1,ZHANG Jun-hui1, MA Xin1,CHEN Jiao-jiao1

(1CollegeofNaturalResourcesandEnvironment,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2CollegeofLifeScience,ShanxiNormalUniversity,Linfen,Shanxi041004,China)

【Objective】 This study aimed to analyze the effects of CaCl2on number and type of culturable actinomycete in low CaCO3soils and develop a new isolation method for actinomycete.【Method】 Soil samples with different CaCO3contents were collected at different elevations from Taibai Mountain,Shaanxi Providence,China.The change in number and type of culturable actinomycete after adding CaCl2to Gause’s synthetic agar in low calcium soils was analyzed by isolating actinomycetes using soil dilution plate technique.The isolates cultured only on medium plus CaCl2were identified based on 16S rDNA sequence analysis.【Result】 Cultured actinomycete and streptomycete counts decreased and some actinomycete species disappeared in CaCl2treatment in all tested samples.A total of 90 actinomycete isolates were only isolated on Gause’s synthetic agar plus CaCl2.Based on the morphological characters and 16S rDNA sequence analysis,29 typical isolates were selected and they were mainlyStreptomycesspp. andMicromonosporaspp.,of which 65.5% showed bioactivities or other application values. 【Conclusion】 Supplement of CaCl2to Gause’s synthetic agar could isolate actinomycete species,including many types that could produce bioactive compounds.

CaCl2;mountain soil;actinomycete isolation;Gause’s synthetic agar

2013-09-11

教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0748)

王东胜(1988-)，男，山西洪洞人，讲师，博士，主要从事放线菌资源及生态研究。 E-mail:wangdongshengwdsh@163.com

薛泉宏(1957-)，男，陕西白水人，教授，硕士，主要从事放线菌资源及生态研究。 E-mail:xuequanhong@nwsuaf.edu.cn

时间:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.018

S154.3

A

1671-9387(2015)01-0175-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.018.html