罗 莹，周冠宇，冯士彬，王希春，吴金节

(安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036)

中药提取物对奶牛乳腺上皮细胞增殖及总蛋白含量的影响

罗 莹，周冠宇，冯士彬，王希春，吴金节

(安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036)

【目的】 研究中药复方灌注液及其中的单味中药提取物对原代培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖及总蛋白含量的影响。【方法】 采用原代组织块贴壁法获得奶牛乳腺上皮细胞，以质量浓度为5，10，15和20 mg/mL的中药复方灌注液以及紫花地丁、黄芪、泽兰、鸡血藤、诃子提取物，分别作用于对数生长期的奶牛乳腺上皮细胞，确定最适宜中药质量浓度，采用该质量浓度提取物处理对数生长期的乳腺上皮细胞，并分别在处理的1，3和5 d时取样，采用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞活性，并测定细胞分泌的总蛋白含量。【结果】 通过组织块贴壁与胰蛋白酶消化法相结合，得到较纯化的奶牛乳腺上皮细胞。泽兰、鸡血藤、复方灌注液在质量浓度为10 mg/mL时能极显著促进奶牛乳腺上皮细胞增殖(P<0.01)，泽兰、鸡血藤、诃子、复方灌注液在质量浓度为15 mg/mL时能极显著提高奶牛乳腺上皮细胞总蛋白的含量(P<0.01)。【结论】 适宜质量浓度的中药作用于奶牛乳腺上皮细胞，可以促进细胞的生长及其总蛋白的分泌。

奶牛乳腺上皮细胞；细胞增殖；中药提取物；总蛋白

体外培养奶牛乳腺上皮细胞开始于1957年，在此后的几十年间，国内外学者对其进行了广泛而深入的研究。2002年，Barash等[1]建立了体外培养的奶牛乳腺上皮细胞系L-1和H-7，并指出L-1细胞能形成乳腺管状结构，而H-7细胞则可形成球状结构。2006年，崔立莉[2]从泌乳中后期健康的荷斯坦奶牛的乳汁中也得到了乳腺上皮细胞，并探讨了亚油酸和维生素A对乳腺上皮细胞的影响。体外培养乳腺上皮细胞对研究正常乳腺发育以及体外各种因素对乳腺发育的影响具有重要意义。

中药是纯天然物质，含有生物碱、萜类、黄酮、皂苷等多种生物活性成分，兼有药物与营养双重功能，且资源丰富，价格低廉，具有广阔的应用前景，日益为国内外专家所关注。目前，有关采用中药制剂治疗奶牛乳房炎的报道较多。王飞等[3]使用“消炎增乳散”对奶牛隐性乳房炎进行治疗，发现其治愈率高达72.2%；周学辉[4]应用“速效乳炎散”治疗奶牛乳腺炎，也起到了相当好的疗效。本实验室研制了治疗奶牛乳房炎的中药复方灌注液，取得了较好的临床效果[5-6]。为进一步探明该中药复方灌注液治疗乳房炎的机制，本试验以奶牛乳腺上皮细胞为研究对象，将中药复方灌注液及其单味中药提取液直接作用于细胞，观察其对乳腺上皮细胞增殖和总蛋白分泌的影响，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样本与中药 奶牛乳腺组织取自安徽省合肥市屠宰场屠宰后的健康经产荷斯坦奶牛。中药紫花地丁、黄芪、泽兰、鸡血藤、诃子，均购自安徽亳州济人药业。治疗奶牛乳房炎的中药复方灌注液(专利号：ZL 2010 1 0132974.7)，组分包括紫花地丁、黄芪、泽兰、鸡血藤、诃子、香附、青皮等。

1.1.2 主要试剂 DMEM-F12培养液、胎牛血清(FBS)和2.5 g/L胰蛋白酶(1×)溶液(Hyclone公司)，DPBS(Gibco公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)(Solarbio公司)，四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma公司)，总蛋白试剂盒(长春汇力生物技术有限公司)，瑞氏-吉姆萨染色试剂盒(南京建成生物技术有限公司)。

1.1.3 主要仪器 SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)，BB15型CO2培养箱(Thermo公司)，XDS-1B型倒置显微镜(重庆光电仪器有限公司)，GF-D200型半自动生化分析仪(山东高密彩虹分析仪器有限公司)，Multiskan Mk3型酶标仪(Thermo 公司)。

1.2 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养与鉴定

1.2.1 乳腺上皮细胞的分离培养 将奶牛乳腺组织用体积分数75%乙醇冲洗1遍后放入托盘中带入实验室内。用手术剪剪取1 cm3大小的组织块，放入含10×双抗的DPBS中清洗3次。将组织块移入2 mL离心管中，加入0.5 mL FBS，用眼科剪将组织尽量剪碎。用1 mL微量移液器吸出剪碎的组织块均匀平铺在6 cm的培养皿中，吸去多余液体，将培养皿倒置在CO2培养箱中。12 h后，倒置显微镜下观察组织块已贴壁后，补加含体积分数10% FBS的DMEM-F12培养液。此后每隔2 d换液。第8 天观察细胞已达到95%汇合，用1 mL的2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化5 min，去除成纤维细胞，重复此步骤3次即可得到较为纯化的奶牛乳腺上皮细胞。待纯化的奶牛乳腺上皮细胞达到90%汇合时，用1 mL的2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化10 min，倒置显微镜下观察乳腺上皮细胞已经基本消化下来后，加入3 mL含体积分数10% FBS的DMEM-F12培养液终止消化，离心去上清后，加入3 mL含体积分数10% FBS的DMEM-F12培养液重悬细胞，将细胞按体积比1∶3传代。

1.2.2 乳腺上皮细胞的染色 弃去第4代第5 天的乳腺上皮细胞培养基，用DPBS清洗2遍，加入甲醇浸泡固定10 min，再按照瑞氏-吉姆萨染色试剂盒说明对细胞进行染色。

1.2.3 乳腺上皮细胞β-酪蛋白的SDS-PAGE电泳 收集第3代培养5 d的乳腺上皮细胞上清液，对乳腺上皮细胞特异分泌物β-酪蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，以奶牛β-酪蛋白标准品为阳性对照。

1.3 中药提取物对乳腺上皮细胞增殖及总蛋白含量的影响

1.3.1 中药提取物的制备 中药提取物的制备均采用溶剂萃取法，在超声波萃取机中进行。其中紫花地丁、黄芪、泽兰、鸡血藤、诃子用乙醇提取，复方灌注液用纯水提取。提取液用旋转蒸发仪浓缩，经0.22 μm滤膜过滤后加入到细胞培养液中。

1.3.2 奶牛乳腺上皮细胞活力的测定 分别收集用质量浓度为5，10，15，20 mg/mL(以生药计)的中药提取物处理1 d的第5代第3天奶牛乳腺上皮细胞，以及用质量浓度为10 mg/mL的中药提取物处理1，3和5 d的第5代奶牛乳腺上皮细胞，采用MTT法测定奶牛乳腺上皮细胞活力。对照组奶牛均不添加中药。具体测定方法如下：将奶牛乳腺上皮细胞在37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养1 d后，每孔加入MTT(5 mg/mL PBS配制)20 μL，继续培养4 h，终止培养。小心弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，选择492 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光值。

1.3.3 乳腺上皮细胞总蛋白含量的测定 分别收集用质量浓度为5，10，15，20 mg/mL的中药提取物处理的第5代第3天奶牛乳腺上皮细胞的培养液，以及用质量浓度为15 mg/mL的中药提取物处理1，3和5 d后的第5代奶牛乳腺上皮细胞的培养液，检测总蛋白含量。对照组奶牛均不添加中药。具体操作步骤按照总蛋白试剂盒说明书进行。

1.4 数据统计与分析

试验数据用SPSS 17.0软件ANOVA方法处理，LSD显著性检验。P<0.05代表差异显著，P<0.01代表差异极显著。采用GraphPad Prism 5软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 奶牛乳腺上皮细胞的形态学观察与鉴定

奶牛乳腺组织块贴壁后，到第7 天时细胞慢慢从组织块中爬出(图1-A)，汇合度已经有50%～60%；纯化后的第3代奶牛乳腺上皮细胞培养5 d时，细胞呈铺路石状贴壁生长，状态良好(图1-B)。

瑞氏-吉姆萨染色结果(图2)显示，奶牛乳腺上皮细胞形态以圆形为主，胞体肥大，胞浆丰满。细胞质疏松，着色较浅。细胞核较大，呈蓝紫色，多为卵圆形，核仁明显(图2-A)。培养至第4代乳腺上皮细胞仍然保持了细胞单层贴壁生长的特性，大多数细胞有2～4个核仁(图2-B)。

由图3可见，奶牛β-酪蛋白标准品的分子质量在26～33 ku，而奶牛乳腺上皮细胞培养液在同样的位置也出现条带，证明奶牛乳腺上皮细胞培养的过程中能够产生β-酪蛋白。

图3 第3代奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白的SDS-PAGE检测结果
A.分子质量14.4～94.0 ku的Marker；B.β-酪蛋白标准品；C.乳腺上皮细胞培养液
Fig.3 SDS-PAGE of bovine mammary epithelial cells’ β-CN
A.14.4-94.0 ku Marker;B.β-CN standard;C.Medium of mammary epithelial cells

2.2 中药提取物对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响

不同质量浓度中药提取物对第5代奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响见表1。由表1可见，采用不同质量浓度中药提取物作用奶牛乳腺上皮细胞1 d后，与对照组相比，紫花地丁、黄芪、泽兰、鸡血藤和复方灌注液对细胞增殖的促进作用不明显(P>0.05)，而诃子在质量浓度为10，15和20 mg/mL时均能极显著促进细胞增殖(P<0.01)，但由于标准差大，测定结果不可靠。紫花地丁、黄芪、泽兰、鸡血藤和复方灌注液在质量浓度为10 mg/mL时OD492 nm值较大，所以选用质量浓度为10 mg/mL的紫花地丁、黄芪、泽兰、鸡血藤和复方灌注液处理奶牛乳腺上皮细胞，研究不同中药处理细胞1,3,5 d后对细胞增殖的影响，结果见图4。

注：表中数据为OD492 nm值；数据后标注“*”表示与对照组相比差异显著(P<0.05)，标注“**”表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)。 下表同。

Note:Data in the table represent OD492 nmvalue;“*” represents significant difference atP<0.05 compared with the control group;“**” represents extremely significant difference atP<0.01 compared with the control group.The same below.

由图4可见，与对照组相比，10 mg/mL的紫花地丁、黄芪、泽兰、鸡血藤提取物和复方灌注液处理奶牛乳腺上皮细胞后，紫花地丁和黄芪对奶牛乳腺上皮细胞增殖作用不明显(P>0.05)；泽兰和鸡血藤从第3 天开始能极显著促进细胞增殖(P<0.01)，而中药复方灌注液在第5天时能极显著促进细胞增殖(P<0.01)。

2.3 中药提取物对奶牛乳腺上皮细胞总蛋白含量的影响

由表2可见，不同中药提取物作用乳腺上皮细胞1 d后，与对照组相比，各质量浓度紫花地丁提取物对奶牛乳腺上皮细胞分泌总蛋白无显著影响(P>0.05)；不同质量浓度的泽兰、鸡血藤、诃子提取物和复方灌注液极显著促进细胞总蛋白分泌(P<0.01)；黄芪提取物极显著抑制细胞总蛋白分泌(P<0.01)。在质量浓度为15 mg/mL时，各中药组奶牛乳腺上皮细胞总蛋白含量最高，所以选用质量浓度为15 mg/mL的紫花地丁、泽兰、鸡血藤、诃子提取物和复方灌注液处理奶牛乳腺上皮细胞，研究不同中药在处理细胞1，3，5 d对总蛋白含量的促进作用，结果见图5。

由图5可见，15 mg/mL的紫花地丁、泽兰、鸡血藤、诃子提取物和复方灌注液处理奶牛乳腺上皮细胞后，与对照组相比，紫花地丁提取物对奶牛乳腺上皮细胞总蛋白含量无显著影响(P>0.05)；泽兰、鸡血藤提取物和复方灌注液在第1天时对奶牛乳腺上皮细胞总蛋白含量有极显著影响(P<0.01)，且随时间增加总蛋白含量增加，差异极显著(P<0.01)。与对照组相比，诃子提取物在第1天时极显著促进奶牛乳腺上皮细胞分泌总蛋白(P<0.01)；第3天总蛋白含量与第1 天相比极显著下降(P<0.01)；第5天总蛋白含量同第3天相比极显著增加(P<0.01)。

图5 中药提取物处理第5代奶牛乳腺上皮细胞总蛋白含量的比较
Fig.5 Comparison of total protein contents of the 5thgeneration bovine mammary epithelial cells after treatment with Chinese herbal extracts

3 讨 论

早在1991年，Hansen等[7]证明，山羊乳腺上皮细胞在体外培养的情况下需要胰岛素、氢化可的松和催乳素的刺激才能分泌β-酪蛋白。本试验通过组织块贴壁法获得纯化的奶牛乳腺上皮细胞，并采用瑞氏-吉姆萨染色和β-酪蛋白SDS-PAGE法进行鉴定[8-9]，证明所获得细胞为生理机能正常的奶牛乳腺上皮细胞。但笔者在细胞培养过程中并没有使用Hansen提出的胰岛素、氢化可的松和催乳素。

奶牛乳房炎在中兽医中属于奶肿、奶黄、乳痈，该疾病的发生与胃热壅滞和肝气郁结[10]有关，治疗奶牛乳房炎应以活血化瘀、清热解毒、消肿散结、痛经下乳为原则[11]。目前，治疗奶牛乳房炎的手段很多，最常用的是化学药物治疗，但是长期使用化学药物容易产生细菌耐药性以及药物残留、污染环境等问题。近几年，使用中药治疗奶牛乳房炎取得了很多成功经验。董禄[12]使用中草药制剂“瓜蒌散加减”来治疗奶牛乳房炎，疗效比较满意。本实验室根据“辩证施治”的原则，研制的治疗奶牛乳房炎中药复方灌注液临床使用效果显著[5-6]。该中药复方灌注液组方中紫花地丁为主药，具有清热解毒、抗菌消炎、凉血消肿、益气活血、散瘀止痛的作用；鸡血藤、黄芪、泽兰共为辅药，具有补气、补血、通经活络、托毒排脓的功能；诃子为使药，具有养气养血、清热解毒、调和诸药的作用。李定刚[13]的研究表明，紫花地丁中的有效成分七叶内酯、东莨菪内酯、茵陈素对奶牛乳房炎中主要致病菌链球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌等均有很好的抑菌效果，其中七叶内酯的抑菌效果最好；丁月云[14]指出，20 mg/mL的黄芪可以促进乳腺上皮细胞增殖。本试验结果显示，泽兰、鸡血藤、复方灌注液在质量浓度为10 mg/mL 时可极显著促进奶牛乳腺上皮细胞增殖(P<0.01)，泽兰、鸡血藤、诃子、复方灌注液在质量浓度为15 mg/mL时可极显著提高乳腺上皮细胞总蛋白的含量(P<0.01)，而紫花地丁对奶牛乳腺上皮细胞的增殖和蛋白分泌无显著作用。诃子对于细胞分泌总蛋白具有显著的促进作用，但诃子中的某些成分与DMSO发生反应产生的黑色物质不利于细胞吸光度的测定，故无法判断诃子是否能够促进细胞增殖。

[1] Barash,Itamar German,Tania.Characterization of an epithelial cell line from bovine mammary gland [J].In vitro Cellular & Developmental Biology-Animal,2002,38(5):282-292.

[2] 崔立莉．奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系的建立及其应用 [D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2006.

Cui L L.Establishment and application of theinvitroculture system of bovine mammary epithelial cells (BMEC) [D].Urumqi:Xinjiang Agricultural University,2006.(in Chinese)

[3] 王 飞，金光明，葛建伟.中草药对奶牛隐性乳房炎的治疗效果观察 [J].安徽技术师范学院学报，2005，19(2)：8-10.

Wang F,Jin G M,Ge J W.Observation on effect of Chinese herbal medicine on mastitis of cows [J].Journal of Anhui Agrotechnical Teachers College,2005,19(2):8-10.(in Chinese)

[4] 周学辉.纯中药剂“速效乳炎散”对奶牛乳腺炎疗效的研究 [J].奶牛养殖，2006(6)：26-27.

Zhou X H.Study the efficacy of new preparations “Suxiao Ruyansan” to dairy cow mastitis [J].Dairy Cow Husbandry,2006(6)：26-27.(in Chinese)

[5] 孟庆娟，冯士彬，李志明，等.中草药及其复方提取物对奶牛乳房炎致病菌的体外抑菌效果 [J].江苏农业科学，2011，39(4)：257-259.

Meng Q J,Feng S B,Li Z M,et al.The antibacterial effect of Chinese herbs extracts and their compound to the mastitis pathogensinvitro[J].Jiangsu Agricultural Sciences,2011,39(4):257-259.(in Chinese)

[6] 孟庆娟，冯士彬，李志明，等.中药复方灌注剂治疗奶牛乳房炎的药效与应用安全性研究 [J].湖北农业科学，2011，50(9)：1846-1850.

Meng Q J,Feng S B,Li Z M,et al.The efficacy and safety of Chinese medicinal herbs compound filler for cattle with mastitis [J].Hubei Agricultural Sciences,2011,50(9):1846-1850.(in Chinese)

[7] Hansen H,Knudsen.Lactation goat mammary gland cells in cu-lture [J].J Comp Biochem Physiol,1991,99:129-135.

[8] 王希春，周 凡，冯士彬，等.中草药提取物对小鼠乳腺上皮细胞增殖的影响 [J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2011，39(7)：16-20.

Wang X C,Zhou F,Feng S B,et al.The effects of herbal extracts of mouse mammary epithelial cell proliferation [J].Journal of Northwest A&F University:Natural Science Edition,2011,39(7):16-20.(in Chinese)

[9] 刘 玮，董雅娟，王文明，等.奶牛乳腺上皮细胞的分离培养及分子生物学鉴定 [J].安徽农业科学，2010，38(6)：2877-2879.

Liu W,Dong Y J,Wang W M,et al.Mammary epithelial cell culture and molecular identification [J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2010,38(6):2877-2879.(in Chinese)

[10] 王 新，张秀英.中药治疗奶牛乳房炎的研究现状与展望 [J].中国兽药杂志，2004，38(2)：43-46.

Wang X,Zhang X Y.The research and prospect of the Chinese medicine’s treatment to mastitis in dairy cows [J].Chinese Journal of Veterinary Drug,2004,38(2):43-46.(in Chinese)

[11] 周新民，周广生，王子轼，等.中药“乳炎灵”注射液对奶牛隐形乳房炎的治疗试验 [J].中兽医医药杂志，2003(6)：38-40.

Zhou X M,Zhou G S,Wang Z S,et al.The test of the treatment of the injection “Ruyanling” to cow mastitis [J].Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine,2003(6):38-40.(in Chinese)

[12] 董 禄.瓜蒌散加减治疗牛乳房炎 [J].中兽医医药杂志，2007(2)：53-55.

Dong L.Gualou powder for treating bovine mastitis [J].Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine,2007(2)：53-55.(in Chinese)

[13] 李定刚.紫花地丁对奶牛乳房炎病原菌的抗菌活性成分研究 [D].陕西杨凌：西北农林科技大学，2006.

Li D G.Antibacterial constituents to pathogenic bacteria of cow mastitis fromViolayedoensisMakino [D].Yangling,Shaanxi:Northwest A&F University,2006.(in Chinese)

[14] 丁月云.王不留行、黄芪对奶牛乳腺上皮细胞体外增殖与分泌功能影响的研究 [D].南京：南京农业大学，2008.

Ding Y Y.Study on the effects of extracts ofSemanvaccaria,Astragalusmembranaceuson the proliferation results and secretion function of cow mammary epithelial cells culturedinvitro[D].Nanjing:Nanjing Agricultural University,2008.(in Chinese)

Effects of Chinese herbal extracts on proliferation and total protein content of cow mammary gland epithelial cells

LUO Ying,ZHOU Guan-yu,FENG Shi-bin,WANG Xi-chun,WU Jin-jie

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036,China)

【Objective】 The purpose of this experiment was to study the effects of Chinese herbal compound perfusion and the single herbal extracts on proliferation and total protein content of cow mammary gland epithelial cells.【Method】 Purified cow mammary gland epithelial cells were obtained by using the original organization block adherent method,and the Chinese herbal compound perfusion and extracts of major constituents(Herbviolae,Radixastragali,Herbalycopi,Herbapaederiae,andFructuschebulae) were prepared.Different levels (5,10,15 and 20 mg/mL) of compound perfusion and extracts were used to treat mammary gland epithelial cells of cows at exponential growth stage.The optimum effective concentration of compound perfusion was determined and was used to treat cow mammary gland epithelial cells.Then,the cell activities were measured by MTT method and TP values were detected at 1,3 and 5 d.【Result】 Purified cow mammary epithelial cells were obtained by the original organization block adherent method and trypsin digestion method.After treatment with different Chinese herbal extracts for 6 days,the cell proliferation was significantly promoted by extracts ofHerbalycopiandHerbapaederiaeas well as compound perfusion at 10 mg/mL level (P<0.01).Total protein content of cow mammary gland epithelial cells was significantly enhanced by extracts ofHerbalycopi,HerbapaederiaeandFructuschebulaeas well as compound perfusion at 15 mg/mL level (P<0.01).【Conclusion】 Chinese herbal perfusion and extracts at suitable concentrations could promote the growth and protein secretion of cow mammary gland epithelial cells.

cow mammary gland epithelial cells;proliferation;Chinese herbal extract;total protein (TP)

2013-09-22

国家农业科技成果转化资金项目(2011GB2C300020)

罗 莹(1990-)，女，安徽滁州人，在读硕士，主要从事奶牛乳腺细胞培养以及中药研究。 E-mail:lyzferik@hotmail.com

吴金节(1962-)，男，安徽望江人，教授，主要从事动物诊疗技术及营养代谢病研究。E-mail:wjj@ahau.edu.cn

时间:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.027

S853.7

A

1671-9387(2015)01-0014-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.027.html