丁永利，姜 勇，宋跃明，陈 星

（1．河南中医学院第一附属医院骨伤科，河南郑州 450000；2．四川大学华西医院骨科，四川成都 610041）

由于成年哺乳动物脊髓的神经细胞已经高度分化，失去有丝分裂的能力，因此脊髓损伤后的再生修复一直是困扰医学界的难题之一［1］。近年的研究表明，脊髓损伤后修复能力有限与胶质瘢痕的空间阻碍、促神经生长因子的缺乏以及神经抑制因子的存在有关［3］。软骨素酶ABC（ChABC）能分解受伤区的硫酸软骨素黏多糖（CS-GAG），清除瘢痕［3］；胶质细胞原性神经营养因子（GDNF）是近年发现的活性最强的新型神经营养因子［4］。本实验利用成年SD大鼠脊髓全横断损伤模型，ChABC、GDNF、抗Nogo-A抗体通过蛛网膜下腔置管灌注，局部单用和联合应用治疗脊髓损伤，采用BDA示踪及 NF-200、GAP-43、GFAP免疫组化等指标评价药物治疗的长期作用，探索损伤脊髓再生新的有效治疗方法。

1 材料与方法

1．1 实验动物 清洁级雌性Sprague-Dawley（SD）成年大鼠，体质量200～250g，2～3月龄，由四川大学华西动物中心提供。动物实验室为SPF级华西临床前药理实验室，室温18～22℃，湿度50%～65%。开始实验前1周购进大鼠以适应实验室环境。

1．2 主要试剂及仪器 GDNF及ChABC购自美国Sigma公司；抗Nogo-A抗体购自美国SANTA公司；BDA购自美国Molecular Probes公司；诱发电位仪及BL-420E＋生物机能实验系统，PE-10导管购自美国BD公司。

1．3 方法

1．3．1 脊髓全横断损伤模型的建立 健康雌性SD大鼠，50g／L水合氯醛腹腔内注射麻醉（0．6mL／100g），以T7～8棘突中心做背部正中切口，显露T7～11椎板，暴露待损伤脊髓，约长4～5mm。将5．5cm长PE-10导管经蛛网膜下腔向头端置入约1cm，将脊髓完全横断，逐层关闭切口。术后每日腹腔注射头孢塞肟钠1mL，每日2次（2．0g／100mL生理盐水），并每日用艾立克行会阴部消毒，以防止伤口和泌尿系感染。并按摩膀胱排尿，每日2次，至其排尿反射恢复。2～3d换垫料1次，保持垫料干燥清洁。

1．3．2 实验分组 将成功造模的大鼠50只，随机分为5组，每组10只：单纯横断组、ChABC组（A组）、GDNF组（G组）、Nogo-A 抗体组（N 组）、ChABC＋GDNF＋Nogo-A抗体组（A＋G＋N组）），另取12只分为2组作为正常对照组和假手术组，后者只咬除椎板，暴露脊髓后蛛网膜下腔置管，然后逐层缝合切口。

正常对照组：放入笼中正常饲养观察。单纯横断组：每日经放置的PE10导管灌注15μL生理盐水，每日1次，共10次。A组：ChABC 6μL／次，隔日1次，共5次；G组：GDNF 4μL／次，每日1次，共10次；N组：Nogo-A抗体（200μg／mL）25μL／次，每日1次，共10次；A＋G＋N组：ChABC 6μL／次，隔日1次，共5次，GDNF：4μL／次，每日1次，共10次，Nogo-A抗体25μL／次，共10次。所有给药均经放置的PE10导管缓慢灌注，处理完毕后，局部消毒拔除导管，合笼饲养。

1．3．3 术后脊髓标本的收集 于24周将各组动物用50g／L水合氯醛腹腔内注射麻醉（0．6mL／100g），动物进人麻醉状态后，采用37℃肝素生理盐水（1支肝素／500mL生理盐水）及灌注液（4℃）灌注后，剪开大鼠背部皮肤，取出脊柱颈胸段，游离脊髓，放人灌注液中后固定，4℃过夜；取出脊髓置于含300g／L蔗糖的灌注液中至组织沉底；然后进行冰冻切片。

1．3．4 生物素葡聚糖胺（BDA）顺行示踪标记技术 取材前2周，将33．3mmol／L BDA溶液缓慢注入大脑两侧的后肢感觉运动区皮质内。2周后行心脏灌注后，取出大脑和脊髓组织，置于40g／L多聚甲醛溶液中4℃后固定过夜，组织沉底后行冰冻纵切片。行BDA染色后脱水及盖玻片覆盖。

1．3．5 免疫组化染色 脊髓损伤后24周，取出脊髓，脊髓损伤段行连续冰冻纵切片，片厚20μm，采用SABC法分别行NF200、GFAP、GAP-43免疫组化染色，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后封片。Olympus显微镜观察并摄片，Image Process图像分析软件进行处理。

1．3．6 体感诱发电位检查（SEP） 各组大鼠于术后24周时取3只行SEP检查。将大鼠用50g／L水合氯醛（剂量同前）腹腔注射麻醉后，暴露硬脑膜及双侧坐骨神经，固定保护电极于坐骨神经上。将引导电极（银球电极）置于前囟矢状缝旁2mm，冠状缝后3mm，用电极操纵器在该范围内移动引导电极，寻找能导出最大幅度诱发电位的中心点。参考电极夹在头皮切口边缘上，地线与动物后肢皮肤相连，使动物接地。记录电极与前置放大器相连；放大后的电信号经BL-420E＋生物机能实验系统，显示并记录于计算机上。

1．4 统计学分析 应用SPSS 13．0软件进行统计分析。计量资料均采用均数±标准差（±s）表示，组间比较在满足正态性和方差齐性的条件下，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较采用LSD检验，以P＜0．05为有统计学意义；若不满足方差齐性，则采用Games-Howell检验，P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 一般情况观察 术后1周内死亡6只，解剖发现腹胀明显；术后大鼠均不同程度出现腹胀、便秘和尿潴留，经注射抗生素、会阴部消毒等，症状消失。术后1周，3只发生自残、自噬腹部或后肢，均死亡。另有2只于术后2周、4周自残后肢死亡。共死亡15只，死亡鼠均予以补充。术后经积极护理，如人工排便、预防感染、勤换垫料、加强营养等，3～4周左右大部分大鼠恢复反射性排尿，腹胀减轻或消失。

2．2 BDA示踪染色 正常对照组：脊髓光镜下见纵形规则排列的纤维束，纤维束间无空泡，细胞核清晰，胞体无空泡样改变。单纯横断组：蓝染的纤维在脊髓近段呈纵形规则排列，愈靠近断端纤维排列愈紊乱；断端的纤维呈横行排列，损伤区及远侧段未见蓝染纤维。A组、G组、N组：损伤区近侧端蓝色的示踪颗粒较多，损伤区很少有蓝色的再生神经纤维，损伤区远侧无蓝染的神经纤维。AGN组：蓝色的神经纤维通过损伤区并出现在损伤区的远侧段，损伤区中央为空泡样变，周围可见蓝染的纤维，损伤区远侧段可见散在的蓝染纤维（图1）。

图1 各组大鼠脊髓组织的BDA示踪染色Fig．1 BDA tracer staining of spinal cord in each group

2．3 NF-200免疫组化染色 NF-200免疫组化染色可见，损伤区以及其远近端强弱不等的NF-200阳性表达，邻近神经元胞体NF-200着色较深。分析各组阳性染色面积，A组、AGN治疗组NF阳性染色强于正常对照组及单纯横断组（P＜0．05）；G、N治疗组与正常对照组比较无统计学差异（P＞0．05）；AGN组较G组、N组显著增强（P＜0．05），与A组未见统计学差异（LSD法，P＞0．05，表1、图2）。

2．4 GAP-43免疫组化染色 GAP-43的着色部位主要在神经元胞质和突起，呈黄色细颗粒状，胞核区不着色。分析各组阳性染色面积，A组、AGN治疗组GAP-43阳性染色强于正常对照组及单纯横断组（P＜0．05），G组、N组与对照组比较无统计学差异（P＞0．05）。AGN组较A、G、N组显著增强（Games-Howell法，P＜0．05，表1、图3）。

图2 各组大鼠脊髓组织的NF200免疫组化染色Fig．2 IHC staining of NF200in spinal cord of each group

图3 各组GAP-43免疫组化染色Fig．3 IHC staining of GAP-43in spinal cord of each group

2．5 GFAP免疫组化染色 GFAP阳性细胞，有明显的多级突起。分析各组阳性染色面积，正常对照组及单纯横断组GFAP阳性染色强于各治疗组（P＜0．05），A组、G组、N组与AGN组比较未见统计学差异（Games-Howell法，P＞0．05，表1、图4）。

2．6 体感诱发电位检查（SEP）分析 术后24周，仅正常对照，AGN组可记录到SEP，其余各组信号均消失，无SEP波形。正常对照组SEP潜伏期为8～12ms，AGN组SEP潜伏期为29ms（图5）。

表1 24周各组大鼠脊髓损伤区免疫组化阳性面积结果Tab．1 Positive area of IHC after spinal cord injury in each group at 24weeks

图4 各组GFAP免疫组化染色Fig．4 IHC staining of GFAP in spinal cord of each group

图5 各组大鼠的SEP波形图Fig．5 SEP wave in each group

3 讨 论

脊髓损伤是脊柱外科的常见病之一。脊髓横断损伤模型能更好地研究脊髓损伤后轴突的再生情况，可确保横断的完全性，对正确评价实验性治疗措施对促进脊髓功能恢复的作用有重要意义［5］。中枢神经系统损伤后再生困难的原因包括中枢神经损伤后神经元极易死亡，损伤导致神经元细胞周围的微环境破坏，营养因子匮乏，多种抑制因子导致神经元再生困难［6］。目前的观点倾向于通过寻找合理的联合治疗方案来克服神经再生的多重障碍。

神经元胞体是神经细胞营养的代谢中心，神经损伤后得以成功修复的前提是防止轴突损伤反应导致的神经元死亡，维持神经元胞体形态和功能的完整［7］。另外，中枢神经系统损伤后再生修复涉及神经元胞体的存活、再生能力的增强，增加微环境中的有利因素，中和抑制性因子等多方面，是受多种因素共同作用的结果。NF是细胞骨架中间丝的一种，在结构和功能上与微管密不可分，损伤脊髓轴突再生或神经细胞功能改善时［8］，NF阳性表达较强，提示再生的神经纤维多。GAP-43的表达与中枢神经系统的反应性突触再生有关，在轴突再生、突触塑性和神经传导中具有重要作用［9］，其表达强表明该物质生成增多，与再生修复的活跃程度有关。GFAP是观察星形胶质细胞的功能状态的重要指标［10］，星形胶质细胞对神经再生的负面效应占优势地位。本研究采用ChABC、GDNF、抗Nogo-A抗体联合应用，可见NF、GAP-43表达增强，GFAP表达下降。目前认为硫酸软骨酶素ChABC是通过去除硫酸软骨素的GAG链而实现中和CSPGs的轴突生长抑制作用的［11］。ChABC可降解CSPGs，使损伤神经元内生长相关蛋白表达上调，促进上、下行神经纤维束再生，运动功能和本体感觉恢复。GDNF是近年发现的一种属于转化生长因子β超家族成员的新型神经营养因子［12］，作用具有广谱性，是目前发现的活性最强的运动神经元营养因子。有研究表明，神经营养因子在髓磷脂降解前能促进轴突生长并通过灰质，而且还能诱导各种生长相关基因的表达［13］。所以，神经营养因子除了对损伤神经元有保护作用外，还可以与其他中和轴突生长抑制因子的方法联合使用以促进轴突生长。GDNF可阻断损伤轴突的中型感觉神经元细胞的病理损害过程，提高背根节细胞的神经传导速度［14］；还能恢复大鼠对伤害性热觉及压觉的敏感性。GDNF能对抗6-羟多巴胺的细胞毒性，使损伤的多巴胺能神经元的死亡率显著下降。局部应用GDNF可保护神经细胞免于自由基等损伤，并能完全阻止缺血后NO的产生以及再灌注造成的损伤，这表明GDNF是有效对抗缺血性损害的保护因子。因此，可以看出，①GDNF促轴突再生的能力较其他两个因子弱；②24周时神经细胞的再生功能趋于静止，故局部维持有效的营养因子浓度可能会更有利于损伤轴突的再生；③应用外源性GDNF能抑制星形胶质细胞的功能。

Nogo-A抗原是已经证实的髓磷脂中3种生长抑制蛋白之一，存在于中枢神经系统的少突胶质细胞和别的一些神经细胞中，是一种跨膜蛋白［15］，目前为止发现其有两个抑制性区域，可以诱导生长锥溃变和抑制轴突生长。脊髓损伤后用单克隆抗体IN-1中和Nogo-A，可促进长纤维传导束的长距离的轴突再生。有研究发现，CNS损伤后Nogo表达不上调，由此推断这种抑制作用是生长的轴突直接与完整或断裂的髓磷脂接触的结果［16］。Nogo-A抗体是通过与抗原结合封闭抗原而起到中和抑制作用的，它和ChABC的作用机制不同，后者通过去除硫酸软骨素的GAG链而中和抑制作用的，这种改变不是一过性的。

综上所述，涉及神经元胞体的存活、再生能力的增强，增加微环境中的有利因素，中和抑制性因子等多方面的联合治疗方案，有助于加深对脊髓再生复杂性及综合干预策略的理解，为中枢神经系统损伤后再生修复治疗方案的探索初步奠定了基础。

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