闫玉鑫

(云南师范大学 职业技术教育学院，云南 昆明 650092)



川黄柏的抗肿瘤化学成分研究

闫玉鑫

(云南师范大学 职业技术教育学院，云南 昆明 650092)

应用现代方法对川黄柏中化学成分及其体外抗肿瘤作用进行研究.从川黄柏中分离鉴定了7个已知化合物，分别为小檗碱(1)、巴马汀(2)、10，11-二甲氧基-13-甲基小檗碱(3)、丁香脂素O-β-D葡萄糖苷(4)、紫丁香酚苷(5)及常见的β-谷甾醇(6)和β-胡萝卜苷(7).以HepG2、MCF7、HT29和MKN28肿瘤细胞株为研究对象，采用MTT法研究了化合物的体外抗肿瘤活性.实验结果显示化合物1和3具有较强的抑制肿瘤细胞HepG2生长的作用，IC50值分别为0.15和0.19 μM.表明川黄柏中得到的化合物对不同种肿瘤细胞具有细胞毒选择性，有一定的抗癌活性.

川黄柏；小檗碱；化学成分；抗肿瘤活性

川黄柏(Phellodendron chinense Schneid.)来源于芸香科黄柏属植物，为乔木，主要分布于我国的陕西和四川[1].其性苦、寒，具有清热消肿止痛等作用，很多历史文献中都有黄柏入药的记载，现代药理研究表明川黄柏在降血糖[2]、抗菌消炎[3]、抗癌[4]及免疫系统疾病[5]等方面有独特的疗效.有关川黄柏的研究主要集中在药理作用与临床应用，化学成分报道的极少.因此，我们对川黄柏的化学成分进行了研究，从中分离并鉴定了7个化合物，分别为小檗碱(1)[6]、巴马汀(2)[7]、10，11-二甲氧基-13-甲基小檗碱(3)[8]、丁香脂素O-β-D葡萄糖苷(4)[9]、紫丁香酚苷(5)[10]以及常见的β-谷甾醇(6)和β-胡萝卜苷(7).化合物3-5首次从该植物中分离得到.

1 仪器与材料

1.1 药材

川黄柏于2011年2月购买于陕西西安药材市场，经昆明植物所李锡文教授鉴定为芸香科黄柏属植物川黄柏(Phellodendron chinense Schneid.)的茎.

1.2 仪器

质谱由英国Micromass产VG Autospec-3000质谱仪测定；NMR谱由Bruker AV-400和DRX-500核磁共振仪测定，四甲基硅烷 (TMS)为内标；芬兰Labsystems MK3酶标仪；美国Revco CO2培养箱；胎牛血清为Hyclone公司产品；RPMI-1640为Gibco公司产品.

1.3 材料

柱色谱用硅胶为青岛海洋化工厂生产(200-300 目)；反相硅胶为Merk公司生产Lichroprep RP-18 (40-63 μm)；Sephadex LH-20为Pharmacia公司产品；薄层色谱材料为青岛海洋化工厂生产的硅胶G和GF254型硅胶；生物碱显色剂为自配的改良碘化铋钾试剂.

2 提取和分离

川黄柏茎干燥粉碎成粉末(30.0 kg)经95%甲醇加热回流提取三次(3×50 L，8 h)，合并提取液并浓缩，加酸水5 000 mL稀释，分别用乙酸乙酯萃取三次，得到非生物碱部分.酸水液碱化至pH=10.0，用氯仿萃取三次得到生物碱部分(280 g).氯仿萃取部分反复上硅胶柱层析，SephadexLH-20，RP-18硅胶柱层析得到化合物1(18 g)、2(25 mg)、3(9 mg)、4(13 mg)、5(26 mg)、6(28 mg)、7(7 g).

3 结构鉴定

化合物1：黄色针状结晶(CH3OH)，改良碘化铋钾试剂反应阳性；分子式C20H18NO4，EI-MS谱给出准分子离子峰 m/z：337[M+H]+；1H，13C NMR(ppm，CD3OD)：H6.96(1H，s，H-1)，7.65(1H，s，H-4)，9.77(1H，s，H-8)，8.00(1H，d，J=9.1，H-11)，8.11(1H，d，J=9.1，H-12)，8.70(1H，s，H-13)，6.10(2H，s，O-CH2-O)，4.10，4.20(6H，各s，2×OCH3).C106.5(d，C-1)，152.2(s，C-2)，149.9(s，C-3)，109.4(d，C-4)，131.9(s，C-4a)，28.2(t，C-5)，57.2(t，C-6)，146.4(d，C-8)，121.9(s，C-8a)，152.0(s，C-9)，145.7(s，C-10)，124.5(d，C-11)，121.5(d，C-12)，135.1(s，C-12a)，128.0(d，C-13)，139.7(s，C-14)，123.3(s，C-14a)，103.7(t，O-CH2-O)，62.5，57.6(q，2×OCH3).以上光谱数据与文献[6]报道的小檗碱基本一致.

化合物2：桔黄色结晶(CH3OH)，改良碘化铋钾试剂反应阳性；分子式C21H22NO4，EI-MS谱给出准分子离子峰m/z：353[M+H]+；1H，13C NMR(ppm，CD3OD)：H7.02(1H，s，H-1)，7.61(1H，s，H-4)，9.74(1H，s，H-8)，8.00(1H，d，J=8.5，H-11)，8.08(1H，d，J=8.5，H-12)，8.72(1H，s，H-13)，3.92，3.97，4.08，4.19(12H，各s，4×OCH3).C109.8(d，C-1)，151.9(s，C-2)，153.7(s，C-3)，112.1(d，C-4)，135.1(s，C-4a)，27.8(t，C-5)，56.6(t，C-6)，145.6(d，C-8)，120.4(s，C-8a)，150.8(s，C-9)，146.3(s，C-10)，124.5(d，C-11)，121.2(d，C-12)，130.0(s，C-12a)，127.9(d，C-13)，139.7(s，C-14)，123.2(s，C-14a)，62.5，57.6，57.3，57.0(q，4×OCH3).综合以上光谱数据与文献[7]报道的数据基本一致，鉴定化合物2为巴马汀(palmatine).

化合物3：黄色针状结晶(CH3OH)，改良碘化铋钾试剂反应阳性，分子式C21H20NO4，EI-MS谱给出离子峰m/z：351[M+H]+；1H，13C NMR(ppm，CD3OD)：H7.02(1H，s，H-1)，7.33(1H，s，H-4)，9.76(1H，s，H-8)，8.13(1H，s，H-9)，8.12(1H，s，H-12)，6.10(2H，s，O-CH2-O)，4.07，4.15(6H，各s，2×OCH3)，1.27(3H，s，CH3).C109.2(d，C-1)，151.9(s，C-2)，148.5(s，C-3)，111.7(d，C-4)，131.8(s，C-4a)，29.1(t，C-5)，57.5(t，C-6)，145.0(d，C-8)，122.6(s，C-8a)，122.1(d，C-9)，151.2(s，C-10)，146.1(s，C-11)，127.1(d，C-12)，134.8(s，C-12a)，135.1(s，C-13)，137.9(s，C-14)，121.9(s，C-14a)，103.6(t，O-CH2-O)，62.6，58.5(q，2×OCH3)，18.2(q，CH3).以上数据与报道的已知化合物10,11-dimethoxy-13-methylprotoberberinium数据基本一致[8]，故鉴定该化合物为10，11-二甲氧基-13-甲基小檗碱.

化合物4：白色粉末，分子式C28H36O13，负离子FAB-MS显示m/z 580；1H，13C NMR：H6.62(2H，s，H-2'，6')，3.74(3H，s，O-CH3')，6.58(2H，s，H-2''，6'')，5.00(d，J=5.2，Glu-H).C54.2(d，C-1)，86.0(d，C-2)，71.8(t，C-4)，54.0(d，C-5)，85.6(d，C-6)，71.6(t，C-8)，131.3(s，C-1')，102.9(d，C-2'，6')，147.3(s，C-3'，5')，134.4(s，C-4')，56.3(q，OCH3')，131.3(s，C-1'')，102.7(d，C-2''，6'')，152.7(s，C-3''，5'')，138.2(s，C-4'')，56.2(q，OCH3'')，Glu：105.5(d，C-1)，74.0(d，C-2)，76.3(d，C-3)，69.5(d，C-4)，75.9(d，C-5)，61.5(t，C-6).波谱数据与文献[9]一致，确定化合物4为丁香脂素O-β-D葡萄糖苷.

化合物5：白色粉末，分子式C34H46O18，EI-MS显示m/z 418，负离子FAB-MS显示m/z 741[MPhellodendron chinense；Berberine；Chemical constituents；Anti-tumorH]-；1H，13C NMR：H6.64(4H，s，H-2'，2''，6'，2'')，3.74(12H，s，4×OCH3)，5.00(2H，d，J=5.2，2×Glc-H).C53.7(d，C-1)，85.2(d，C-2)，70.0(t，C-4)，133.7(s，C-1')，104.2(d，C-2'，6')，152.7(s，C-3'，5')，137.2(s，C-4')，56.5(q，OCH3')，Glc：102.7(d，C-1)，74.2(d，C-2)，77.3(d，C-3)，71.5(d，C-4)，76.6(d，C-5)，61.0(t，C-6).与文献[10]一致，确定化合物5为紫丁香酚苷.

β-谷甾醇(6)：无色针晶(氯仿)，TLC与标准品β-谷甾醇Rf值一致.

β-胡萝卜苷(7)：白色粉末，TLC与标准品β-胡萝卜苷Rf值一致.

4 体外抗肿瘤细胞活性试验

对数生长期的人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(MCF7)、人结肠癌细胞(HT29)和人胃癌细胞(MKN28)以每孔0.19 mL的量分别接种于96孔板，细胞数为0.4×104/孔，细胞培养24 h待贴壁后，分别加入10 μL不同浓度的药物，同时设空白对照组，药物作用72 h，培养结束前4 h加入MTT，继续在37℃培养4 h，倾去培养液，加入DMSO 0.1 mL，用酶联仪以570 nm 测定去除本底光吸收值后的吸收度(A)值，并以Bliss计算IC50值，IC50=(1-样品的A值/对照组的A值)×100%，实验结果见表1.

表1 化合物 1-5 的细胞毒活性(IC50μM)Table 1 Cytotoxicity of compounds 1-5(IC50μM)

5 讨 论

实验从川黄柏中得到7个已知化合物，包括3个原小檗碱型生物碱、2个木质素苷、2个甾醇类化合物，化合物3-5为首次从该植物中得到.对从黄柏中得到的部分化合物进行细胞毒实验，大部分化合物对人肝癌细胞株的细胞毒活性十分明显；化合物1对人胃癌细胞株有一定的细胞毒活性，其余化合物对人乳腺癌细胞株、人结肠癌细胞株和人胃癌细胞株细胞毒活性不明显.

综上所述，所得化合物对不同种肿瘤细胞具有细胞毒选择性，其抗癌作用机制和构效关系需要更深一步进行研究.本研究从化合物单体水平进一步证明了药用植物川黄柏具有一定的抗癌活性，为合理开发利用该植物奠定了理论基础.

[1] 中国科学院中国植物志编写委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社,2004.

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[3] 王德全，胡俊英.黄柏胶囊抗炎疗效临床分析[J].中华实用中西杂志，2004，4(17):839-840.

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[10]萧艳华，曹辉，张国林.水麻的化学成分研究[J].天然产物研究与开发，2008，20(1):52-55.

Anticancer Activity of Constituents from Phellodendron chinense

YAN Yu-xin

(College of Vocational and Technical Education,Yunnan Normal University,Kunming 650092,China)

Various techniques were used to study the chemical constituents and the anti-tumor effect of the plant Phellodendron chinense.Seven compounds were isolated and identified as berberine(1),palmatine(2),10,11-dimethoxy-13-methylprotoberberinium(3),syringaresinol-4-O-β-D-monoglycoside(4),syringiaresinoldiglycoside(5),β-sitosterol(6),β-daucosterol(7).The inhibitory effects of these compounds on HepG2,MCF7,HT29 and MKN28 cell lines were tested in vitro by MTT method.Compounds 1 and 3 exhibit potent effect against HepG2, with IC50values of 0.15 and 0.19 μM,respectively.The study suggests that the compounds from Phellodendron chinense have the anti-tumor effects and these cytotoxic activities on different tumor cell lines are various and selective.

Phellodendron chinense；Berberine；Chemical constituents；Anti-tumor

2015-03-19

云南省教育厅基金资助项目(2014Y146).

闫玉鑫(1982-)，女，山东菏泽人，讲师，主要从事次生代谢产物方面研究.

闫玉鑫.

R284

A

1007-9793(2015)03-0075-04