牟界 王杰 张文斌 雷文汇

（重庆市中医院呼吸内科，重庆 400011）

致炎因子和炎症介质导致的血管内皮细胞（endothelium）损伤是脓毒血症（sepsis）、急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）以及冠状动脉硬化性心脏病（coronary arteriosclerotic heart disease，CAD）等炎症性疾病共同的病理生理特征［1－5］。目前认为，改善和减轻血管内皮细胞损伤是治疗脓毒血症、ARDS 和CAD 等炎症性疾病的关键［6，7］。山柰酚（kaempferol）属于黄酮 类化合物（flavonoid），在包括绿茶、西兰花和藏红花等多种植物中广泛存在［8－11］。目前研究发现山柰酚具有抑制炎症反应、抑制氧化应激、抑制细菌病毒生长、调节肿瘤增殖和侵袭以及调节糖代谢等广泛的药理作用［8－11］。同时Kim TH 等的研究发现山柰酚抑制炎症反应的机制与抑制高迁移率族蛋白1（High mobility group box－1protein，HMGB1）密切相关，但具体的分子机制并不明确［12］。本研究旨在探讨山柰酚对脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）炎症反应的影响及其潜在分子机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料 TRIzol试剂和qPCR 试剂盒购自宝生物工程有限公司；鼠抗人HO－1抗体、鼠抗人HMGB1抗体和鼠抗人β－actin抗体均购于美国Santa Cruz公司；山柰酚购于美国Sigma公司，DMEM 培养基购于美国Gibco公司，小牛血清购于杭州四季清，其余试剂均为分析纯。

1.2 细胞培养 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）常规接种在含10%胎牛血清、100g／L 青霉素、100g／L 链霉素的RPMI 1640 培养液中，置于37℃、95%空气、5%CO2孵箱内培养。每48h换液、传代2次，取对数生长期细胞用于实验。人脐静脉内皮细胞分为对照组（Control组）、LPS组和LPS＋山柰酚（LPS＋KF组）。其中对照组细胞加入PBS；LPS组和LPS＋KF组加入终浓度为1μg／ml的LPS；LPS＋KF组加入终浓度为80μM 的山柰酚溶液进行干预［13］。

1.3 细 胞HMGB1 和HO－1 mRNA 表达检测qPCR 法检测HMGB1和HO－1mRNA 表达水平，按照试剂盒说明书提取细胞的总RNA 并合成cDNA。然后进行荧光定量PCR 扩增，反应体系为25μl，使用β－actin作为内参照。引物序列如下：HMGB1正义5′－TTAAAAACCTGGATCGGAACCAA－3′，反 义5′－GCATT AGCTTCAGAT TTACGGGT－3′；HO－1 正义5′－GGCTG ACAAGG CTCGTTATG－3′，反义5′－GGGC GGTACTCAGAA CAGAAC－3′；β－actin：正义：5′－CCCAG CACAATGA AGATCAAGA TCAT－3′，反义：5′－ATCTG CTGGAAGGT GGACAGCGA－3′。使用2－ΔΔCt法对MCP－1和HMGB1 mRNA 表达水平进行测定，ΔΔCt ＝（Ct，目标－Ct，β－actin）干预组－（Ct，目标－Ct，β－actin）对照组。

1.4 Western blotting 法检测细胞中HMGB1 和HO－1蛋白表达水平 干预24h后，按照试剂盒操作要求，首先提取HUVECs细胞总蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE），然后转移至硝酸纤维素滤膜上，用脱脂奶粉封闭1h，分别加入鼠抗人抗体HMGB1（1∶900）、HO－1（1∶800）和β－actin（1∶1500），4℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1000），用ECL 进行显色，用凝胶成像分析系统进行扫描。

1.5 统计学方法 计量资料以均数±标准差表示。采用SPSS 17.0进行单因素方差分析，两样本均数多重比较采用LSD 法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HMGB1 mRNA 和蛋白的表达 干预24h 后，使用qPCR 法和western blot法对人脐静脉内皮细胞HMGB1mRNA 和蛋白的表达水平进行检测。与对照组相比较，在LPS 干预后人脐静脉内皮细胞HMGB1mRNA 和蛋白的表达水平明显增加，差异均有显著统计学意义（P 均＜0.05）。但LPS组较LPS＋山柰酚组HMGB1mRNA 和蛋白的表达增加更加明显，差异均有显著统计学意义（P 均＜0.05），见表1和图1。

表1 人脐静脉内皮细胞HO－1和HMGB1mRNA和蛋白表达水平（n＝5，）Table 1 The mRNA and protein expression of HO－1and HMGB1in HUVECs

表1 人脐静脉内皮细胞HO－1和HMGB1mRNA和蛋白表达水平（n＝5，）Table 1 The mRNA and protein expression of HO－1and HMGB1in HUVECs

注：①与对照组相比较P＜0.05；②与LPS组相比较P＜0.05。

图1 人脐静脉内皮细胞HMGB1蛋白表达的western blot结果Figure 1 The western blot results of HMGB1protein expression in HUVECs

图2 人脐静脉内皮细胞HO－1蛋白表达的western blot结果Figure 2 The western blot results of HO－1protein expression in HUVECs

2.2 HO－1mRNA 和蛋白的表达 表1和图2可知，干预24h后，使用qPCR 法和western blot法对人脐静脉内皮细胞HO－1mRNA 和蛋白的表达水平进行检测。与对照组相比较，在LPS干预后人脐静脉内皮细胞HO－1mRNA 和蛋白的表达水平明显降低，差异均有显著统计学意义（P 均＜0.05）。但LPS 组较LPS＋山柰酚组HO－1 mRNA 和蛋白的表达下降更加明显，差异均有显著统计学意义（P 均＜0.05）。

3 讨论

血管内皮细胞（endothelium）主要是指内衬于血管最内侧的单层扁平上皮细胞。研究发现血管内皮细胞不仅仅具有维持血管壁结构完整性的作用，还广泛参与了凝血与抗凝调节、免疫炎症调节、组织再生、血压以及内分泌调节等多种生理和病理过程［4－7，14］。目前认为血管内皮细胞是脓毒血症、ARDS以及动脉粥样硬化等炎症性疾病的主要损伤部位［4－7，14］。同时，大量研究证实抑制和减轻炎症因子导致的血管内皮细胞损伤对于改善脓毒血症、ARDS以及动脉粥样硬化等炎症性疾 病均具有 积极作用［4－7，14－18］。Lee W等研究证实穿心莲内酯可以通过抑制HMGB1 表达对脓毒血症状态下的小鼠具有保护作用，并认为与改善血管内皮细胞损伤密切相关［15］。何健卓等的研究发现血必净注射液可以通过调节血管内皮细胞功能改善脓毒血症患者的微循环状态和血流动力学异常［16］。Qin M 等研究显示杨梅树皮苷可以通过PI3K／Akt信号通路减轻ox－LDL 诱导的血管内皮细胞凋亡对动脉粥样硬化产生保护作用［17］。Zhang Y等的研究发现miR－26a可以通过调节TRPC6表达改善ox－LDL诱导的血管内皮细胞凋亡［18］。以上实验表明血管内皮细胞的功能状态在脓毒血症和动脉粥样硬化等炎症性疾病的发生和发展过程中扮演着重要的角色，减轻和改善血管内皮细胞的损伤对于治疗炎症性疾病具有积极的意义和价值。

山柰酚（kaempferol）属于黄酮类化合物（flavonoid），在多种蔬菜和水果中均发现山柰酚的存在。目前大量的研究表明山柰酚及其衍生化合物具有抑制炎症反应、抑制氧化应激、抑制细菌和病毒生长、调节肿瘤增殖和侵袭以及调节糖代谢等广泛的药理作用［8－12，19，20］。Yang QS等的研究发现山柰酚可以通过抑制TNF－α和IL－6等炎症介质的表达和过度的氧化应激反应对失血性休克小鼠多个器官产生保护作用［11］。同时，Chung MJ等的研究发现山柰酚及其衍生物对于卵清蛋白（ovalbumin，OVA）诱导的气道炎症反应有显著的抑制作用［19］。Tang XL 等的研究证实山柰酚可以有效抑制LPS和ATP诱导的心肌成纤维细胞炎症反应［20］。进一步Kim TH 等的研究发现山柰酚抑制炎症反应的机制与下调高迁移率族蛋白1（High mobility group box－1protein，HMGB1）密切相关，但具体的分子机制仍不明确。

血红素氧化酶－1（heme oxygenase－1，HO－1）又称为热休克蛋白32（heat shock protein 32），其分子量为32kD，属 于热休克蛋白家族成员之一［21，22］。HO－1广泛存在于细胞的微粒体中，主要参与自由铁、一氧化碳和胆绿素等的代谢过程。目前研究发现HO－1同时还参与了炎症反应和氧化应激反应的调控［21，22］。在炎症状态下上调HO－1 的合成与表达对于改善细胞和器官功能有积极作用［21，22］。近期研究表明HO－1 是HMGB1重要的调节因素［21，22］。Li Y等的研究发现在小鼠ARDS模型中氢气可以通过上调HO－1的合成抑制HMGB1 的表达改善肺组织的炎症反应，并改善模型动物的死亡率［21］。Kim YM 等的研究也证实在巨噬细胞系RAW264.7细胞中甘草皂苷可以通过上调HO－1 的合成抑制LPS 诱导的HMGB1的表达［22］。本实验结果表明在人脐静脉内皮细胞中山柰酚可能可以通过上调HO－1的合成抑制LPS诱导的HMGB1的表达。

4 结论

山柰酚可能可以通过上调HO－1抑制LPS诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）HMGB1的表达，提示山柰酚对炎症状态下的血管内皮细胞具有保护作用。本研究为山柰酚应用于脓毒血症和ARDS等炎性疾病的治疗奠定了一定的基础。

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