廖应英，孙泽群，李彩丽，查火龙(.湖北中医药大学，湖北武汉430065；.十堰市人民医院消化内科，湖北44000)

食管癌目前严重威胁着人们的身体健康，是消化系统常见的恶性肿瘤之一。有研究表明，槲皮素(quercetion)是从槲皮中提取的一种5-羟基黄酮类化合物，为无毒中药，具有多种生物学活性[1-3]。槲皮素作用广泛，不仅能够抑制多种肿瘤细胞的增殖及促进肿瘤细胞凋亡，与其他抗肿瘤药物联用后可增强药物对肿瘤细胞的敏感性，而且在扩张冠状动脉、抗氧化、抗血小板聚集、镇痛等方面有多种药理作用，这种化合物在低浓度时可以刺激人体细胞扩散，在高浓度、凋亡情况下能消除感染或异常细胞，可作为一种潜在的抗癌药物，临床应用广泛。槲皮素可以干扰细胞酶、受体、转运蛋白和信号系统[4]，但其抑制肿瘤细胞增殖及促进凋亡的分子机制目前仍未研究清楚。本研究通过槲皮素对人食管癌E-ca109细胞增殖与凋亡的影响，为临床抗肿瘤治疗提供帮助，为进一步探讨其抗肿瘤的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 槲皮素粉剂购于Sigma公司；RPMI1640培养液、胰蛋白酶购自Gibco公司；新生牛血清购自四季青生物公司。

1.1.2 槲皮素的配制 取槲皮素粉剂18 mg，溶解于1 mL二甲基亚砜(DMSO)中，配成母液，使用含10%新生牛血清RPMI1640培养液稀释，使DMSO终浓度小于1/1000，现配现用。

1.2 方法

1.2.1 细胞株及体外培养 人食管癌Eca109细胞(湖北省十堰市人民医院食管肿瘤研究所提供)；体外培养Eca109细胞，将其接种在RPMI1640培养基中(含10%左右新生牛血清)，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每天观察细胞形态及数目，每隔2～3 d用0.25%胰蛋白酶消化细胞后传代1次，连续传3代后，取对数生长期的细胞。

1.2.2 噻唑蓝(MTT)法检测槲皮素对Eca109细胞增殖的影响 将传3代后的Eca109细胞用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，使用标准的细胞计数板计数，调整细胞浓度为1×104mL-1到96孔板上，每孔加100 μL细胞悬液，在37℃条件下培养24 h，见细胞贴壁后加入含有不同浓度槲皮素的培养液各200 μL，再设1个空白对照组(只加培养基即槲皮素0 μmol/L)。每组设5个平行孔，连续3 d共准备3块96孔板，1、2、3块板分别培养72、48、24 h，之后每孔加入 MTT 溶液(5 mg/mL)20 μL，放置在37℃、5%CO2条件下继续孵育4 h后终止，倾去板中培养液。将每孔中加入150 μL DMSO，平板振荡10～15 min，使蓝紫色结晶溶解。用酶标仪于490 nm下测定各孔光密度(OD)值(以空白孔调零；根据公式：细胞增殖抑制率[IR(%)]=(OD对照组-OD给药组)/OD对照组×100%计算出各组细胞的增殖IR。

1.2.3 流式细胞仪检测凋亡率 用0.25%胰蛋白酶消化，离心后弃上清液，加入磷酸盐缓冲液(PBS)1 mL洗涤，洗掉残留的胰酶，然后离心5min再弃上清液，收集细胞。加入 400 μL1×Binding Buffer轻轻重悬细胞，再加入5 μL AnnexinⅤ-FITC，轻轻混匀，室温下避光孵育约15 min，加入 10 μL 碘化丙啶(PI)染色剂，再次轻轻混匀，冰水中避光放置5 min。30min内检测细胞凋亡率。

1.3 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用Anova检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 槲皮素对Eca109细胞增殖的抑制作用 根据结果观察不同浓度槲皮素作用Eca109细胞24、48、72 h后，其增殖被显著抑制，并随着药物浓度的增加、作用时间的延长，细胞增殖抑制作用逐渐增强，MTT法检测出OD值随着浓度的增加、作用时间的延长逐渐降低，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。在作用72 h及最大浓度320 μmol/L时所得出的OD值根据公式计算出的细胞增殖IR最高，提示该浓度时细胞增殖抑制的作用最为明显。不同浓度的槲皮素在不同时间点处理Eca109细胞的结果，IR随着时间增加而升高，各组与前一个时间点比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.1.1 不同浓度槲皮素对Eca109细胞增殖IR的量效关系 不同浓度的槲皮素作用Eca109细胞后，得出的OD值和公式计算出的IR与空白对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，随着浓度的增加，IR逐渐增加，细胞增殖抑制逐渐增强，且差异均有统计学意义(P<0.05)。说明随着槲皮素浓度的增加，其对Eca细胞增殖抑制作用逐渐增强，与剂量呈正相关。见图1。

表1 不同浓度槲皮素作用Eca109细胞不同时间段OD 值及 IR 比较(n=9，OD490nm)

图1 不同浓度槲皮素对Eca109细胞IR的影响

2.1.2 槲皮素作用不同时间对Eca109细胞增殖IR的时效关系 槲皮素在不同浓度条件下作用Eca109细胞，分别培养24、48、72 h后，MTT法检测出的OD值根据公式计算出的IR，每组浓度随培养时间的延长，细胞增殖IR逐渐上升，每个浓度槲皮素与前一组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，结果表明不同浓度槲皮素对Eca109细胞的增殖抑制作用与时间的延长有明显的相关性。见图1。

2.2 不同浓度槲皮素对Eca109细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示，不同浓度槲皮素对Eca109细胞作用24 h后检测出的细胞凋亡率不同，随着浓度的增加其数值逐渐升高，且明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示槲皮素促进细胞凋亡的作用逐渐增强，见图2。

图2 不同浓度槲皮素作用Eca109细胞凋亡率

3 讨 论

食管癌患者确诊时多已是中晚期，因其早期症状隐匿，很多患者错过了外科手术的机会，预后差，生存率较低。调查发现，我国食管癌的死亡率位居恶性肿瘤的第4位，年平均病死率为15/10万，且目前发病趋于年轻化[5-6]，严重影响了人们的生活质量及身体健康。因此，对该病进行深入研究、提高临床治疗效果、改善患者的生活质量，是当前研究的重中之重。

自1971年美国首次发现槲皮素在临床白血病治疗中发挥一定作用后，多项研究发现，槲皮素可抑制多种癌细胞的增殖，如结肠癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、膀胱癌等，同时可以诱导肿瘤细胞凋亡，其抗肿瘤的作用机制有待进一步研究。槲皮素在肝细胞癌中的凋亡效应可能为通过调节特异性蛋白1(Sp1)来发挥作用[7]。在胃癌的研究中，槲皮素能够抑制血管内皮生长因子(VEGF)介导的内皮细胞迁移和血管生成，主要是通过下调胃癌细胞内VEGF mRNA及其蛋白的表达。小鼠的动物实验结果提示，槲皮素可以抑制前列腺癌组织中微血管的生成，主要通过减少小鼠体内肿瘤微血管的密度，从而减少肿瘤组织中VEGF的表达。槲皮素可能增加乳腺癌细胞对阿霉素的化学敏感性，与单独使用阿霉素治疗相比，联合治疗可显著抑制细胞增殖和入侵，增加细胞凋亡、上调人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)的表达和磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(p-AKt)的表达[8]。近年来，各种研究报道了miRNAs与人类癌症的相关性，发现槲皮素在乳腺癌的治疗中，对细胞增殖的影响在人乳腺癌细胞系MCF-7和MDAMB-231有没有转染miR-146a的模仿或反miRNANA-146a。此外，Bax和cleaved-caspases-3主要是增加了控制和超表达miRNA-146a，但是表皮生长因子受体(EGFR)的表达是相反的[9]。这些研究结果都反映出槲皮素在抑制肿瘤细胞增殖及促进凋亡方面均有良好的效果[10-14]。

本实验研究在体外培养Eca109细胞，以不同浓度的槲皮素作用该细胞后用MTT法检测出槲皮素对Eca细胞的增殖抑制率，用流式细胞仪检测Eca细胞的凋亡率，从而探讨槲皮素对Eca109细胞增殖与凋亡的影响。MTT实验证实，在不同时间的情况下，随着槲皮素浓度的增加，各组均出现细胞增殖抑制，且抑制作用逐渐递增。实验过程中为了进一步了解不同浓度槲皮素对E ca109细胞作用早期的抑制率情况，曾检测作用6、12 h后对人食管癌Eca109细胞增殖的影响，但2个时间段的抑制率比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。流式细胞仪检测结果显示，槲皮素对Eca109细胞凋亡有促进作用，随着时间的增加，细胞凋亡率逐渐增加，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果对临床治疗食管癌的过程可以提供一定的帮助。目前食管癌患者确诊时多数已处于中晚期，错过了外科手术治疗的最佳时期，只能选择化疗或放疗，选择化疗时，其他抗肿瘤药物可联合槲皮素抑制食管癌细胞的增殖及促进凋亡，提高化疗效果，改善远期预后，延长患者生命。

综上所述，槲皮素可抑制食管癌细胞的增殖并促进其凋亡。迄今为止，槲皮素的抗肿瘤作用机制研究不多，具体通过何种途径发挥抗肿瘤作用有待研究，可能与抑制肿瘤组织VEGF的表达有一定的相关性。通过抑制其表达来抑制食管癌的增殖、转移，从而控制肿瘤的发展，还可能与凋亡蛋白Bcl-2、Bax等基因的高表达有一定的相关性，目前此类研究较少，有待进一步研究探讨。

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