贾佩，肖红卫，刘西梅，郑新民，许生成，张立苹

摘要：试验比较了几种不同化学激活方法[试验Ⅰ：不同浓度乙醇溶液作用不同时间+2 mmol/L 6-二甲基氨基嘌呤溶液（6-DMAP）作用4 h对猪体外成熟卵母细胞进行激活处理;试验Ⅱ：不同浓度离子霉素作用不同时间+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h对猪体外成熟卵母细胞进行激活处理]对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活效率的影响。结果表明，10%的乙醇溶液作用10 min+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h及10 μmol/L的离子霉素作用10 min+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h可获得较高的囊胚率，其囊胚率分别为16.09%、13.24%。

关键词：猪;卵母细胞;孤雌激活

中图分类号：S828.3        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5802-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.045

卵母细胞的人工激活是核移植供体细胞核基因组重新编程，启动核移植胚正常发育的重要环节[1]，同时也是提高胞质内单精注射效果的重要措施[2]。卵母细胞的激活方法有很多种，一般可分为物理激活法（电脉冲、机械刺激、温度变化等）和化学激活法（钙离子载体A23187、离子霉素、氯化锶、乙醇、放线菌酮、蛋白合成抑制剂等）。孤雌激活方法对激活效率的影响较大，离子霉素和乙醇是常用的人工激活剂，用于哺乳动物体外成熟卵母细胞的孤雌激活。本研究着重探讨了离子霉素和乙醇结合蛋白激酶抑制剂6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）对体外成熟卵母细胞孤雌激活的影响，以期获得在本实验室条件下较优的化学孤雌激活方法，为胚胎培养体系的建立和体细胞核移植技术的研究提供必要的方法和手段。

1  材料与方法

1.1  成熟培养液基础液配制及各种试剂来源

成熟培养液的基础液成分如下：TCM-199（Gibco）添加3.05 mmol/L葡萄糖、0.91 mmol/L丙酮酸钠、0.57 mmol/L L-半胱氨酸、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL的硫酸链霉素、10%（V/V）卵泡液、10 IU/mL孕马血清促性腺激素（PMSG）和10 IU/mL人绒毛膜促性腺激素（hCG）;DPBS购自Gibco公司。本试验中所有化学试剂及生物试剂除特殊标明外均购自Sigma公司。

1.2  猪卵巢及卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus-oocyte complexes，COCs）的收集

从屠宰场摘取经产母猪卵巢，立即放入添加双抗的35 ℃灭菌生理盐水中2～4 h内送回实验室。卵巢组织用灭菌且预热的生理盐水清洗3次，然后用带标准20号针头的无菌注射器（内有少量平衡后的DPBS）抽取卵巢表面直径为3～8 mm的卵泡，抽取液注入50 mL尖底离心管中，置于39 ℃的水浴锅中。待COCs沉淀后，用DPBS洗涤2次，后在立体显微镜下检卵。A级：卵丘细胞在3层或3层以上。B级：卵丘细胞为1～2层;或卵丘细胞虽在3层或3层以上，但是不完整，部分为1～2层。C级：裸卵或卵丘细胞虽为1～2层或多层，但是不完整，部分裸露。本试验取A级及B级COCs用于成熟培养。

1.3  卵母细胞的体外成熟培养

检出的COCs用添加双抗（10 IU/mL）的DPBS洗涤3次，然后用成熟培养液洗涤3次，最后按试验设计分别移入含有成熟培养液的五孔板中，每孔100枚。含成熟培养液的五孔培养板预先在CO2培养箱中平衡2 h以上。成熟培养条件为39 ℃、5%的CO2与饱和湿度。

1.4  猪卵泡液的制备

用带有标准20号针头的5 mL注射器抽吸直径3～8 mm卵泡中的卵泡液，3 000 r/min离心30 min，0. 22 μm微孔滤膜过滤，分装，-20 ℃冻存。

1.5  卵母细胞的孤雌激活及孤雌激活胚胎的培养

将成熟培养44 h的COCs移入含0.1%透明质酸酶的无钙镁离子的DPBS中消化除去卵丘细胞，按照试验设计进行激活处理，激活后用胚胎培养液NCSU-23洗涤3次后放入预先平衡好的NCSU-23微滴中进行胚胎培养。培养条件为39 ℃、5%的CO2与饱和湿度。每48 h观察一次， 分别统计其卵裂率和囊胚率。

1.6  试验设计

1）考察不同浓度（9%、10%）的乙醇溶液作用不同时间（8、10、13、15 min）+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活的影响。将成熟的卵母细胞用操作液洗涤 3 次，再用不同浓度（9%、10%） 的乙醇溶液迅速洗涤 3 遍，分别用不同浓度（ 9%、10%）的乙醇溶液作用 8、10、13、15 min 后，移入 2 mmol/L 的 6-DMAP 中作用4 h，然后移入 NCSU-23中培养。每 48 h 观察一次，记录其卵裂率和囊胚率。

2）考察不同浓度（5、10、15 μmol/L）离子霉素作用不同时间（10、20、30、40 min）+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活的影响。将成熟的卵母细胞用操作液洗涤 3 次，再分别用不同浓度（5、10、15 μmol/L）离子霉素洗涤 3 遍，分别用不同浓度（5、10、15 μmol/L）离子霉素作用 10、20、30、40 min 后，移入 2 mmol/L 的 6-DMAP 中作用4 h，然后移入 NCSU-23中培养。每 48 h 观察一次，记录其卵裂率和囊胚率。

1.7  数据处理

每个试验重复3次以上，数据采用？字2检验。

2  结果与分析

2.1  不同浓度的乙醇溶液作用不同时间对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活的影响

由表1、表2可见，9%乙醇溶液进行处理时，作用10 min获得的囊胚率最高，显著（P<0.05）高于8 min和15 min处理组;10%的乙醇溶液进行处理时，处理10 min获得的囊胚率最高，显著（P<0.05）高于其他处理组。综合来看，从胚胎后续发育的结果而言，10%的乙醇溶液作用10 min+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h对猪体外成熟卵母细胞的激活效果最好，其囊胚率为16.09%。

2.2  不同浓度离子霉素作用不同时间对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活的影响

由表3、表4、表5可见，5 μmol/L的离子霉素各处理组间囊胚率差异不显著;10 μmol/L的离子霉素各处理组中，作用10 min的处理组的囊胚率显著（P<0.05）高于其他处理组;15 μmol/L的离子霉素各处理组中，作用20 min和30 min的处理组的囊胚率显著（P<0.05）高于其他处理组。综合来看，从胚胎后续发育的结果而言，10 μmol/L的离子霉素作用10 min+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h对猪体外成熟卵母细胞的激活效果最好，其囊胚率为 13.24%。

3  小结与讨论

乙醇对卵母细胞的激活主要是通过水解细胞膜上PIP，产生IP。IP诱发细胞内源钙释放到细胞质中，提高了胞内的游离钙离子浓度来实现激活卵母细胞[3]，而离子霉素对卵母细胞的激活作用主要是通过动员细胞内的Ca2+，依次触发Ca2+内流而引起细胞内Ca2+浓度升高[4]，两者的激活机理有所不同。6-DMAP则是通过影响MAPK和MPF的活性来激活卵母细胞[5]，它能够抑制成熟促进因子和细胞静止因子的活性，同时也抑制第二极体的排放，保证孤雌激活卵母细胞的染色体为二倍体[6]。由于二倍体的孤雌胚胎比单倍体的孤雌胚胎发育能力强，因此，为提高牛、兔等动物卵母细胞的激活效率，常用离子霉素、乙醇、电脉冲等与CHX、6-DMAP联合激活[7]。

大量研究表明，用7%～8%的乙醇作用5～7 min可获得较好的卵裂率，随作用时间的延长激活率呈降低趋势。刘国世等[8]用不同方法对猪卵母细胞进行激活，乙醇激活组中以9%乙醇溶液激活处理3 min效果最佳;Yi等[9]用8%乙醇溶液处理10 min 获得最为理想的猪卵母细胞激活效果;赵金凤[10]用乙醇处理猪卵母细胞后，移入 2 mmol/L 的 6-DMAP 中处理4 h，结果显示9%乙醇溶液作用10、20 min 后孤雌胚的卵裂率和囊胚率均显著高于其他处理组。本研究结果显示，10%乙醇溶液作用10 min+2 mmol/L 6-DMAP处理4 h能获得较好的囊胚率（16.09%），这与赵金凤[11]的试验结果一致，但与其他学者的报告结果不一致。乙醇的纯度决定了乙醇激活的不稳定性，卵母细胞的质量和试验季节也会造成试验结果的差异。

国外有报道称低浓度离子霉素（如5 μmol/L）短时间作用效果较好，当离子霉素浓度较高时短时间作用效果明显，作用时间达30 min后其卵裂率和囊胚率下降，这可能与高浓度离子霉素的毒性有关。Betthauser等[11]采用15 μmol/L的离子霉素20 min，1.9 mmol/L 6-DMAP 处理3～4 h的化学激活方法，获得了2窝4头克隆猪。刘国世等[8]认为，15 μmol/L的离子霉素作用40 min+2.0 mmol/L 6-DMAP处理3～4 h的激活效率较好。赵金凤[10]研究表明，5 μmol/L和10 μmol/L的离子霉素作用20 min均能获得较高的卵裂率。乔利敏等[12]比较了不同浓度离子霉素对牛卵母细胞的激活效率，结果表明，10 μmol/L的离子霉素作用10 min能获得较优的卵裂率和囊胚率。本试验研究结果显示，10 μmol/L的离子霉素作用10 min+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h可获得较高的囊胚率（13.24%）。此结果与上述诸学者结果稍有不同。影响卵母细胞孤雌激活效率的因素很多，如卵母细胞成熟质量、实验室条件、试验季节等。

本研究比较了猪卵母细胞化学激活的试验参数，为克隆转基因动物及胚胎早期发育的发生机制、基因印记等研究奠定了基础。

参考文献：

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[11] BETTHAUSER J，FORSBERG E，AUGENSTEIN M，et al.Production of cloned pigs from in vitro systems[J].Nature biotechnology，2000，18：1055-1059.

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