饶犇，王亚平，李娜，周荣华，廖先清，刘芳，陈伟，张光阳，杨自文

摘要：探讨溶氧对于多粘芽孢杆菌发酵的影响。结果表明，溶氧量为40%时，多粘芽孢杆菌的芽孢数和抑菌物质产量均达到最高值，分别为10×109个/g和1.2%。在此基础上又进行了通过补料技术控制溶氧的试验，结果表明，补料能较好的提高多粘芽孢杆菌的芽孢数和抑菌物质产量，分别达到15×109个/g和1.5%。

关键词：多粘芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）;溶氧;补料发酵

中图分类号：Q813.1        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5745-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.030

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是芽孢杆菌科（Bacillaceae）类芽孢杆菌属（Paenibacillus）的革兰氏阳性细菌，在划入类芽孢杆菌属（Paenibacillus）之前又称Bacillus polymyxa。多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）的细胞呈杆状，（0.5～2.5） μm ×（1.2～10.0） μm，G+C含量为40%～50%;利用周生鞭毛运动，在膨大孢子囊中产生椭圆型芽孢;最适生长pH 7，最适温度为28～30 ℃;兼性厌氧，分解葡萄糖和其他糖类产酸，有时产气，在营养琼脂上无可溶性色素，应用前景广阔[1]。

传统农药和化肥的过量使用导致很多植物病虫产生抗药性，造成生态环境的恶性循环，因此高效、安全的微生物农药和生物化肥越来越受到人们的关注。而多粘类芽孢杆菌能分泌大量的活性物质，对许多细菌和真菌有抑制活性，能提高植物的抗病能力，促进植物生长，提高产量，并能产生多肽类抗菌物质，对植物病原真菌有较好的拮抗活性。它是一种较好的生防细菌。另外，多粘芽孢杆菌还具有多种酶活、抗氧化和抗肿瘤等生物活性。

多粘芽孢杆菌能产生多种抗菌物质，比如多粘菌素（Polymyxin），粘菌素（Colistin），环杆菌素（Circulin）;杀镰孢菌素（Fusaricidins）等，这些物质的产生和产量与发酵培养基和发酵条件密切相关，如温度，pH，溶氧，补料与否等[2-4]。在这些因素中间，溶氧是非常重要的一个因素，且对于多粘芽孢杆菌自身菌体的生长和芽孢形成有重要影响。如何根据多粘芽孢杆菌的特点，合理控制发酵不同阶段的溶氧水平，提高发酵生产水平，对其工业化有重大的意义。

本研究以实验室分离得到的多粘芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa NR1为研究对象，考察不同溶氧条件下多粘芽孢杆菌的芽孢形成及数目，以及对其中几种抗菌物质的产量的影响。

1  材料与方法

1.1  菌株

多粘芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa NR1（实验室自行筛选）。

1.2  培养基

1.2.1  种子培养基  葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉2%。

1.2.2  发酵培养基  葡萄糖 1%，豆粕2%，蛋白胨1%，酵母粉1%，碳酸钙0.5%，pH 6.5～7.0。

1.3  分批发酵研究

从斜面上接一环菌到摇瓶种子培养基中，28 ℃，200 r/min下培养至对数期后期，以5%接种量接入30 L发酵罐（上海保兴公司），装料20 L，罐压0.02 MPa，在发酵过程中通过空气流量及搅拌转速控制对溶氧进行控制，因为加入了碳酸钙，故pH不予控制。

1.4  补料发酵研究

装料20 L，罐压0.02 MPa，转速300 r/min，空气流量1 vvm，配制60%的葡萄糖补料液，后面根据溶氧要求灵活的控制补料速率直至芽孢形成。

1.5  分析方法

1.5.1  溶氧测定  梅特勒溶氧电极在线测定。

1.5.2  菌丝浓度测定  Eppendorf 台式离心机5 000 r/min离心10 min。

1.5.3  芽孢数测定  活菌数按常规平板计数法测定[5]，检测芽孢数前，将菌液在80 ℃预处理20 min，再按照常规平板计数法测定[6，7]。

1.5.4  抗生素含量测定  首先将发酵液直接冻干成粉末，采用甲醇萃取，萃取液采用HPLC测定，条件：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为0.01 mol/L三氟乙酸-乙腈，从77.0%～75.5%二元梯度洗脱;流速为1.0 mL/min;紫外检测波长为205 nm;进样量为20 μL;柱温为30 ℃。

2  结果与分析

2.1  多粘芽孢杆菌临界氧浓度的确定

多粘芽孢杆菌菌体浓度进入稳定期之后，突然停止通气，观察溶氧电极指数的变化。由图1可知，刚开始溶氧直线下降，而当其降到约20%时，下降速率变小。这说明溶氧为20%以下时，多粘芽孢杆菌的呼吸会受到影响，也表明该菌是一个极度高耗氧微生物，溶氧对其影响非常大，20%的溶解氧浓度是该菌的生长临界溶解氧浓度。

2.2  不同溶氧下多粘芽孢杆菌发酵的动力学特征

图2表明刚开始接种的15 h内，发酵液中溶氧浓度较高，有利于菌体的生长。随着发酵时间的延长，过高溶氧浓度并不利于多粘芽孢杆菌菌体的生长。数据显示最佳溶氧是40%，该条件下菌体浓度可以达到最高，为42%。而由图3可知，不同溶解氧浓度也影响几种代谢产物多粘菌素和杀镰孢菌素等的生成速率及最终发酵液中它们的含量。图3显示溶氧为40%的情况下抑菌物质生成速率均要大于其他两个溶氧浓度下的生成速率，并且该溶氧条件下抑菌物质的最终浓度要大于其他条件下的最终浓度。

2.3  不同溶氧下多粘芽孢杆菌芽孢形成的比较

这里考察了不同溶氧对多粘芽孢杆菌芽孢形成的影响，当42 h发酵结束时，测定芽孢数，计算芽孢形成率。从表1中可以得知，当溶氧为40%时，芽孢形成率最高，同时由于该条件下菌体浓度最高，所以形成的芽孢数也是最多的。

2.4  利用补料技术控制多粘芽孢杆菌发酵过程中的溶氧

由于前面试验已经证明了该菌是一个极度高耗氧微生物，而在分批的情况下碳源已经全部加入了培养基，这就导致分批发酵时的溶氧不会很好，只能在非常高的转速下（700 r/min以上）才能达到比较好的溶氧效果，但是这样的培养条件不利于放大。为此笔者采用补料分批的方法流加碳源， 以提高发酵过程中的溶氧， 达到提高芽孢数和抑菌物质产量的目的。当溶氧上升时开始补料，灵活的控制补料速率保存溶氧在40%波动， 结果（表2）表明补料发酵确实能提高产品的芽孢数和生物活性物质的产量。

3  小结与讨论

多粘芽孢杆菌在自然环境中栖息广泛，不仅常见于土壤、植物体表以及植物的根、低茎等部位，而且是常见的植物内生细菌。由于具有良好的抗生作用、溶菌作用、诱导抗性和促生作用等，研究人员将其作为生物农药或者生物肥料施用于大田中，均反馈产生了较好的效果，这促使了相当多的研究机构和厂家关注以及研究该菌[8，9]。但是由于多粘芽孢杆菌比较难形成芽孢以及产素水平较低，市场上较难见到产品。研究了溶氧对于多粘芽孢杆菌发酵的影响，发现过高或者过低的溶氧都不利于其形成芽孢和产素，只有在溶氧为40%时，发酵水平才能达到最高。为达到该目的，后面又进行了通过补料技术控制溶氧的试验，结果表明补料能较好的提高多粘芽孢杆菌的芽孢数和抑菌物质产量，分别达到15×109个/g和1.5%，以上研究结果为后面的工业化打下了良好的基础。

参考文献：

[1] 郭兴华.益生菌基础与应用[M].北京：科学技术出版社，2002.

[2] 顾觉奋.抗生素[M].上海：上海科学技术出版社，2001.

[3] 俞俊棠.生物工艺学[M].北京：化学工业出版社，2003.

[4] 华南工学院.发酵工程与设备[M].北京：轻工业出版社，1983.

[5] 周德庆.微生物学实验手册[M].上海：上海科学技术出版社，1986.

[6] 杜连祥.工业微生物学实验技术[M].天津：天津科学技术出版社，1992.

[7] 沈  萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，1999.

[8] 赵德立，曾子林，李  晖，等.多粘芽孢杆菌JW-725抗菌活性物质及其发酵条件的初步研究[J].植物保护，2006，32（1）：47-50.

[9] 李福彬，陈宝江，于会民，等.多粘芽孢杆菌抗逆性与益生性的体外评价[J].河北农业大学学报，2010，33（3）：78-82.