田宇曦，刘晓艳，张志刚，杨自文

摘要：通过PCR技术将2种不同来源的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）cry1Ac蛋白基因克隆到大肠杆菌pGEX-6P-1表达载体，并转化到宿主菌BL21，采用IPTG进行诱导表达，并用亲和层析法进行融合蛋白的纯化，纯化后的蛋白质进行玉米螟的室内生物测定试验。结果表明，来自Bt菌株NBIN-866的Cry1Ac蛋白杀玉米螟的LC50为65.39 μg/mL，来自Bt菌株NBIC-380的Cry1Ac蛋白杀玉米螟的LC50为15.07 μg/mL，后者具有更高的杀虫活性。氨基酸序列比对发现来自菌株NBIC-380的Cry1Ac氨基酸序列的71位和393位都为丝氨酸S，而NBIN-866的都为脯氨酸P，推测这两个位点的氨基酸的变化可能是影响毒性大小的重要因素。

关键词：苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）;Cry1Ac;融合蛋白;玉米螟;活性比较中图分类号：S188            中图分类号：S476        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5742-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.029

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种土壤革兰氏阳性细菌，具有较广的杀虫谱。其主要的杀虫活性物质是杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein，ICP）[1]。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等500多种昆虫及线虫等原生动物有毒杀活性[2]。目前关于Cry蛋白中Cry1Ac蛋白结构以及功能方面的研究，国内外均有报道，如在Cry1Ac蛋白末端融合其他蛋白以提高杀虫活性[3-5]或者将另一种蛋白与其一起共表达来提高杀虫活性[6]。本研究通过克隆表达两类不同来源的Cry1Ac蛋白，生物测定发现对玉米螟的杀虫活性差异较大，从一级结构上分析了可能影响毒性大小的氨基酸位点，为后续该蛋白质结构的研究提供理论基础。

1  材料与方法

1.1  材料

菌种：分离自土壤的两株含有cry1Ac基因的苏云金芽胞杆菌菌株NBIC-380和NBIN-866以及大肠杆菌菌株DH5α和BL21保存于湖北省生物农药工程研究中心;pGEX-6P-1购自Invitrogen公司;T4连接酶、Ex Taq酶、Bam HI、Sal I、Hind Ⅲ、DNA Marker（各条带大小依次为23 130、9 416、6 557、4 361、2 322、2 027、564 bp）、即用型蛋白质分子量标准（各条带大小依次为200、116、97.2、66.4、44.3、29.0、20.1、14.3、6.5 kDa）、pMD19-T Simple Vector购自TaKaRa公司;透析袋和透析夹购自伯乐生命医学（上海）有限公司;SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司;基因组DNA提取试剂盒（树脂型）购自上海赛百盛基因技术有限公司;细菌蛋白抽提GST琼脂糖凝胶和快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京赛驰生物科技有限公司;其他化学试剂均为分析纯。

1.2  方法

1.2.1  克隆  用细菌总基因组提取试剂盒抽提苏云金芽胞杆菌NBIC-380和NBIN-866的总基因组，对于NBIC-380的Cry1Ac，以菌株NBIC-380总基因组为模板，采用引物Cry1A-F：GGATCCATGGATAACAATCCGAACATC，下划线处是Bam HI酶切位点和Cry1A-R：GTCGACTACACGAACAATCTAAGTCAG，下划线处是Sal I酶切位点），在PCR条件（94 ℃、1 min;94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、150 s，25个循环;72 ℃、5min;16 ℃、5 min）下进行PCR扩增，PCR产物命名为2-Cry1Ac;对于菌株NBIN-866的Cry1Ac，以菌株NBIC-866总基因组为模板，采用引物Cry1A-F和Cry1A-R，在PCR条件（94 ℃、1 min;94 ℃、30 s，49 ℃、30 s，72 ℃、150 s，25个循环;72 ℃、5 min;16 ℃、5 min）下进行PCR扩增，PCR产物命名为5-Cry1Ac。将PCR产物割胶，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，先连入pMD19-T Simple Vector进行TA克隆，通过蓝白斑筛选、PCR验证和双酶切验证挑选正确的转化子，送去上海生工生物工程股份有限公司测序，将正确的转化子通过Bam HI和Sal Ⅰ双酶切下来连入同样酶双酶切处理完全的pGEX-6P-1表达载体，通过PCR和单酶切验证后将正确的转化子的质粒转入宿主菌BL21。

1.2.2  融合蛋白表达与纯化  在28 ℃、IPTG终浓度为0.5 mmol/L、诱导5 h进行重组蛋白的表达，参照北京康为世纪生物科技有限公司细菌GST融合蛋白抽提说明书，采用GST标签的亲和层析纯化方法纯化融合蛋白，通过SDS-PAGE检测，将纯化的目的条带较浓杂带较少的纯化液于4 ℃用透析袋透析过夜，透析缓冲液采用1倍的磷酸缓冲液。透析后的蛋白质采用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行浓度测定。

1.2.3  生测试验  将透析后的蛋白质参照文献[7]进行玉米螟的室内生物测定试验。采用LD50数据处理软件统计两种蛋白质的LC50。

2  结果与分析

2.1  pGEX-6P-1-Cry1Ac原核表达载体的构建结果

通过PCR扩增获得了2个分别来自Bt NBIC-380和NBIN-866的2.4 kb的cry1Ac基因片段（图1A），将TA克隆得到的转化子进行菌落PCR验证、双酶切验证（图1B）以及测序验证，结果表明该转化子是阳性克隆。将阳性克隆重组质粒上两个基因片段双切下来连入用相同的酶切过的pGEX-6P-1表达载体上，通过PCR验证和单酶切验证（图1C）表明，2个基因成功地克隆到了pGEX-6P-1表达载体上。

2.2  大肠杆菌诱导表达与纯化结果

在28 ℃用0.5 mmol/L IPTG诱导5 h，用亲和层析法纯化得到了融合蛋白（图2），融合蛋白分子量大小约为118 kDa。用BCA蛋白浓度测定试剂盒对以上纯化并透析过的融合蛋白进行浓度测定，带有GST标签的2-Cry1Ac和5-Cry1Ac的浓度分别为190 mg/mL和199 μg/mL。

2.3  室内生物测定试验结果

将带有GST标签的2-Cry1Ac和5-Cry1Ac稀释成3个浓度进行玉米螟的室内生物测定试验，采用LD50数据处理软件统计得到两种蛋白质的LC50分别为15.07和65.39 μg/mL。可见，2-Cry1Ac杀玉米螟的活性是5-Cry1Ac的4倍以上。

2.4  两种蛋白质氨基酸序列的比对结果

因为2-Cry1Ac杀玉米螟活性是5-Cry1Ac的4倍以上，采用MegAlign软件将两种蛋白质的氨基酸序列进行比对以期找到毒性更高的原因。由图3可知，在两种蛋白质的核心功能域[2]里，2-Cry1Ac（来自菌株NBIC-380的Cry1Ac）氨基酸序列的71位为S、393位为S，而5-Cry1Ac（NBIN-866的）分别为P、P，其余序列完全一样。通过在MMDB数据库找到已经报道的Cry1Ac的3D结构（MMDB ID：110041），找到了2-Cry1Ac/5-Cry1Ac氨基酸序列上相应的71位和393位，由图4可知，两个氨基酸位点都是突出在蛋白质结构的表面。P和S都是中性氨基酸，不过P是非极性氨基酸，而S是极性氨基酸，这两个结构域上的71和393位由P变成S后，使蛋白质杀玉米螟的活性提高了3倍多，原因还需要进一步分析。

3  小结与讨论

从2个来源的Bt NBIC-380和NBIN-866里PCR分别得到了2-Cry1Ac和5-Cry1Ac，将其克隆到pGEX-6P-1表达载体上，然后利用大肠杆菌进行表达，并进行融合蛋白的亲和层析柱纯化，纯化的两种蛋白质中NBIC-380的2-Cry1Ac杀玉米螟的活性约是NBIN-866的5-Cry1Ac的4倍。分析这两种蛋白质的氨基酸序列可知，2-Cry1Ac氨基酸序列的71位为S、393位为S，而5-Cry1Ac分别为P、P，其余序列完全一样。71位氨基酸位于内毒素N内，393位氨基酸位于内毒素M上（http：//www.rcsb.org/pdb/protein/P05068？ evtc= Suggest& evta= UniProtGene%20Names&evtl=OtherOptions），两个氨基酸位点都是突出在蛋白质结构的表面，P和S都是中性氨基酸，不过P是非极性氨基酸，而S是极性氨基酸，这两个结构域上的71和393位由P变成S后，使蛋白质杀玉米螟的活性提高了3倍，推测这两个位点的氨基酸的变化可能是影响毒性大小的重要因素，接下来将针对这两个氨基酸位点展开进一步研究。

参考文献：

[1] 喻子牛.苏云金杆菌[M].北京：科学出版社，1990.

[2] SCHNEPF H E，CRICKMORE N，RIE J V，et al. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins[J]. Microbiol Mol Biol Rev，1998，62（3）：775-806.

[3] TANG Y，TONG J Y，ZHANG Y L，et al. Preliminary comparing the toxicities of the hybrid cry1Acs fused with different heterogenous genes provided guidance for the fusion expression of Cry proteins[J]. World J Microbiol Biotechnol，2012，28：397-400.

[4] YAN F，CHENG X，DING X Z，et al. Improved insecticidal toxicity by fusing Cry1Ac of Bacillus thuringiensis with Av3 of Anemonia viridis[J]. Curr Microbiol，2014，68：604-609.

[5] TAJNE S，BODDUPALLY D，SADUMPATI V，et al. Synthetic fusion-protein containing domains of Bt Cry1Ac and Allium sativum lectin（ASAL） conferred enhanced insecticidal activity against major lepidopteran pests[J]. Journal of Biotechnology，2014，171：71-75.

[6] PENG D，XU X，RUAN L，et al. Enhancing Cry1Ac toxicity by expression of the Helicoverpa armigera cadherin fragment in Bacillus thuringiensis[J]. Res Microbiol，2010，161（5）：383-389.

[7] 张志刚，杨自文，王开梅，等.新型新杀虫剂的高通量筛选方法研究[J].湖北农业科学，2010，49（12）：3045-3048.