董丹，关统伟，车振明*

（西华大学微生物研究所，食品生物技术四川省高校重点实验室，四川成都610039）

杂色曲霉最适生长条件及抗药性实验研究

董丹，关统伟，车振明*

（西华大学微生物研究所，食品生物技术四川省高校重点实验室，四川成都610039）

从发酵8个月豆瓣瓣子中分离获得1株曲霉，编号为JC1156。经真菌18S rRNA分子鉴定该菌为杂色曲霉（Aspergillus versicolor），与其最高同源性菌株的相似度为100%；对该菌的最适生长条件及抗药性进行研究发现该菌的最适生长温度为28℃、pH值为6.0、盐含量为5%。测定了25种常用抗菌药物对该菌的抑菌性，结果显示，在25种抗菌药物中，该菌对9种药物具有抗性；分别为可奇霉素、林可霉素、环丙沙星、卡那霉素、头孢西丁、妥布霉素、奈替米星、克林霉素以及红霉素。

杂色曲霉；抗药性；生长条件

郫县豆瓣是以豆瓣为原料、霉菌为主要微生物菌种，经自然制曲、天然发酵而成的特色调味品。传统的豆瓣生产可大致分为3个阶段：发酵制曲阶段、发酵初期和发酵后期。豆瓣发酵过程中的微生物组成相当丰富，不同时期微生物的组成也存在一定的差异。曲霉一般存在于制曲阶段和瓣子发酵初期[1]。曲霉的种类有很多，如黄曲霉（A.flavus）、烟曲霉（A.fumigatus）、灰绿曲霉（A.glaucus）、构巢曲霉（A.nidurans）、寄生曲霉（A.parasiticus）、土曲霉（A.terreus）和杂色曲霉（A.versicolor）等。曲霉菌是发酵工业和食品工业的重要菌种，已被利用的近60种，但同时曲霉菌也是造成食物腐败变质的罪魁祸首，其是过敏性哮喘、过敏性鼻炎的常见诱因；杂色曲霉菌为曲霉菌属的一种，是湿热的沿海地区和内陆常见的室内外致敏真菌[2]。杂色曲霉、构巢曲霉和离蠕孢霉是产生杂色毒素的主要菌种[3]。上述这些霉菌广泛存在于自然界中，会导致大麦、小麦、玉米、大豆、奶酪等粮食、食品和饲料的污染，尤其是对小麦、玉米的污染最为严重。产毒素最高的是杂色曲霉，其次是构巢曲霉和离蠕孢霉[4-5]。杂色曲霉毒素（sterigmatocystin，ST）是日本学者YUICHI H等[6]从杂色曲霉菌丝体中首先分离并命名的，当时未引起人们的重视。直至1960年英国爆发“火鸡X病”证实为黄曲霉毒素中毒并有致癌作用[7-11]，从此才对结构与其相似的杂色曲霉毒素引起注意。本实验从发酵8个月豆瓣瓣子中分离获得1株杂色曲霉（Aspergillus versicolor）JC1156，为进一步了解该菌株的生理特性，对其最适生长条件及抗药性进行了研究，针对目前许多小型豆瓣企业黄曲霉毒素超标的问题，对豆瓣中产毒素菌株的研究十分有必要，这对未来豆瓣生产中黄曲霉毒素含量的控制及豆瓣产品品质的改善提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验菌株

从发酵8个月豆瓣瓣子中分离得到的曲霉，编号为JC1156，菌株分别以30%甘油管和20%牛奶罐保存于-20℃。

1.1.2 试剂

核酸染料（goldview）、三羧甲基氨基甲烷（Tris碱）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、TE缓冲溶液（Tris-EDTA buffer）：上海生工生物工程有限公司；蛋白胨、甘油、无水乙醇、异戊醇、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、大豆磷脂、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）：成都市科龙剂化工厂；ExTaqDNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphote，dNTP）：大连Takara公司；PCR产物胶回收试剂盒（离心柱）：捷瑞生物工程（上海）有限公司。

1.1.3 抗菌药物

本实验共选用25常用药敏试纸（链霉素、庆大霉素、青霉素G、可奇霉素、林克霉素、多粘菌素B、奈替米星、奈替米星、呋喃妥因、新生霉素、萘啶酸、环丙沙星、卡那霉素、头孢西丁、氧氟沙星、复方新诺明、妥布霉素、克林霉素、红霉素、氯霉素、氨苄西林、羧苄青霉素、诺氟沙星、头孢噻胯、利福平）：杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.4 培养基

LB（Luria-Bertani）培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）[12]：土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，水1 000 mL，自然pH。

1.2 仪器与设备

LDZX-75KB型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2F型双人双面净化工作台：苏州净化有限公司；DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱、DHP-9052型电热恒温培养箱：上海益恒实验仪器有限公司；TB-214型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；PHS-3C型酸度计：方舟科技有限公司；9700型PCR扩增仪：美国应用生物系统公司；NGS721型分光光度计：北京中惠天城科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 霉菌的分子鉴定

DNA的提取：DNA的提取采用改良十六烷基三甲溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）[13-14]法。得到的样品总DNA于-20℃保存，作为后续PCR的模板。

PCR及产物的纯化：以提取得到的DNA为模板，选择真菌引物ITS4（5'-CCTCCGCTTATTGATATGC-3'）；ITS5（5'-GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）。反应条件：95℃、4 min；94℃、30 s，53℃、30 s，72℃、40 s，35个循环；72℃、7min。PCR反应体系为50μL：10×Buffer5μL、dNTP4μL、Taq酶0.5 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 37.5 μL、DNA模板1 μL。PCR产物用1.4%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳时间40 min。纯化过程按照DNA胶回收试剂盒中的步骤进行，具体步骤参照OMEGA公司E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit试剂盒说明。

测序：PCR产物纯化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果提交NCBI（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/）进行Blast（Basic Local Alignment Search Tool）序列分析。

1.3.2 菌株母液的制备[15]

在LB斜面培养基上接种供试菌，放入30℃的恒温培养箱中培养48 h制成斜面种子，然后挑取1环菌种于装有20 mL灭菌后的液体PDA培养基的100 mL三角瓶中，置于温度为30℃，转速为200r/min的恒温振荡培养箱中培养48h。

1.3.3 盐含量对菌株生长的影响

取0.5 mL菌株母液于装有20 mL灭菌后的分别加入盐含量为0、5%、10%、15%、20%的PDA液体培养基中，共5个锥形瓶，置于温度为30℃、转速为200 r/min的恒温振荡箱中培养24 h，以液体PDA培养基作空白对照，用分光光度计测定波长660 nm处的吸光度值。菌株的生长情况越好，菌体密度越大，吸光度值越大。

1.3.4 温度对菌株生长的影响

取0.5 mL菌株母液于装有20 mL灭菌后的PDA液体培养基中，分别置于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，转速为200 r/min的恒温振荡培养箱中培养28 h，以液体PDA培养基为空白对照，用分光光度计测定波长660 nm处的吸光度值。

1.3.5 pH值对菌株生长的影响[16]

将液体PDA培养基分别用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，取0.5 mL菌株母液于装有20 mL已调好pH值的液体PDA培养基的100 mL三角瓶中，放入温度为30℃，转速为200 r/min的恒温振荡箱中培养28 h，以液体PDA培养基作空白对照，用分光光度计测定波长660 nm处的吸光度值。

1.3.6 菌株抗药性检测

抗菌药物平板制备：在LB平板上加入100 μL母液，用涂布棒涂均匀后，用标记笔将平板分为五等分，在每个部分放入一张药敏性试纸，于30℃恒温培养箱中培养24 h，观察有无抑菌圈的产生。

2 结果与分析

2.1 菌株的分子鉴定

杂色曲霉经PCR凝胶呈像结果见图1。

将JC1156测序结果进行拼接过后，在Genbank数据库进行Blast序列比对，序列号为JX506349，经同源性对比与Aspergillus versicolor相似度为100%，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》以及生理生化鉴定和分子生物学鉴定，最终确定JC1156为Aspergillus versicolor。

2.2 菌株最适生长条件研究结果

2.2.1 盐含量对菌株生长的影响

高盐环境能抑制微生物的生长繁殖，当微生物浸泡在高盐环境中时会因为细胞内外渗透压过大，导致细胞内部严重失水直至微生物的死亡。盐含量对菌株JC1156生长的影响见图2。

由图2可看出，盐含量为0～5%时，随着盐含量的增加，菌体密度逐渐增大，在盐含量为5%时，菌体密度达到最大值，盐含量＞5%后，随着盐含量的升高，菌体密度逐渐降低。表明适宜的盐含量有利菌株的生长。菌株JC1156杂色曲霉最适生长盐含量为5%。

2.2.2 温度对菌株生长的影响

温度的高低影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢，过高的温度会导致蛋白质或核酸的变性失活，而过低的温度会使酶活力受到抑制，细胞的新陈代谢活力减弱[17]。不同温度对菌株生长的影响结果见图3。

由图3可看出，温度在24～28℃内，随着温度的升高，菌体密度逐渐增大，当温度为28℃时，菌体密度最大，当温度＞28℃后，随着温度的升高，菌体的密度逐渐降低。表明适宜的温度有益于菌株的生长。菌株JC1156的最适生长温度为28℃。

2.2.3 pH值对菌株生长的影响

在最适pH条件下，微生物细胞能达到最高生长率。在此pH值下，微生物的细胞量达到最大，并且细胞生长过程中所需的有关酶的活性也最高。不同pH值对菌株生长的影响结果见图4。

由图4可看出，pH值在4.0～6.0内，菌体密度逐渐增大，在pH值为6.0时，菌体密度达到最大，在pH值＞6.0后，随着pH值的增大，菌体密度逐渐减小。由此得出菌株JC11546生长最适的pH值为6.0。

2.2.4 菌株抗药性实验结果

为了了解该曲霉的药敏情况，以便为杂色曲霉的防治提供参考依据，本研究检测了菌株JC1156对25种抗生素的抗药性，测定结果如表1所示。

由表1可以看出，在菌株的抗药性实验中，菌株JC1156对9种常用药物具有抗性，分别为可奇霉素、林可霉素、环丙沙星、卡那霉素、头孢西丁、妥布霉素、奈替米星、克林霉素以及红霉素。

3 结论

本实验采用纯培养的方法从发酵8个月豆瓣瓣子中分离得到一株曲霉菌，经18S rRNA分子鉴定得知该株曲霉为杂色曲霉（Aspergillus versicolor），编号为JC1156。通过对其最适生长条件及抗药性研究得到该菌的最适生长温度为28℃、最适生长pH值为6.0、最适生长盐含量为5%，在抗药性实验中，该菌对9种常用药物都具有抗性。本实验的研究结果对于豆瓣中杂色曲霉菌生长的抑制以及杂色曲霉毒素的控制提供了理论依据，为更好的保证豆瓣生产品质奠定基础。

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DONG Dan,GUAN Tongwei,CHE Zhenming*
(Key Laboratory of Food Biotechnology in Colleges and Universities in Sichuan Province,Institute of Microbiology, Xihuan University,Chengdu 610039,China)

AspergillusJC1156 was isolated from eight months’fermented soybean paste.The strain was identified asAspergillus versicolorby 18S rRNA molecular identification,and it was 100%homology with the highest homology strains.The optimal growth conditions and drug resistance of the strain was studied.The results showed that the optimum condition was temperature 28℃,pH 6.0 and salt concentration 5%.Meanwhile,25 kinds of commonly antibacterial drugs were used to study antibacterial activity of the bacteria.The results showed that the strain was resistant to nine kinds of drugs:spectinomycin,lincomycin,ciprofloxacin,kanamycin,cefoxitin,tobramycin,netilmicin,clindamycin and erythromycin.

Aspergillus versicolor;drug resistance;growing conditions

Q93-331

A

0254-5071（2015）04-0051-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.012

2015-03-24

教育部春晖计划项目（No.13205639）

董丹（1989-），女，硕士研究生，研究方向为食品加工。

*通讯作者：车振明（1960-），男，教授，本科，研究方向为食品发酵技术。