袁海延，于慧，王好，周井祥，张瑞雪，刘建平，马跃，王钊

（吉林农业大学，长春130118）

锦鲤疱疹病毒病的研究进展

袁海延，于慧，王好，周井祥∗，张瑞雪，刘建平，马跃，王钊

（吉林农业大学，长春130118）

就锦鲤疱疹病毒病的病原学、流行病学特征、临床症状、检测方法和防治技术方面取得的成果进行了综述，为研究和预防锦鲤疱疹病毒病提供参考。

锦鲤疱疹病毒；分子生物学；检测方法；防治技术

锦鲤疱疹病毒病（Koi Herpesvirus Diease，KHVD）是由锦鲤疱疹病毒（Koi Herpesvirus，KHV）引起的一种高传染性和高致死性的疾病，主要感染锦鲤、普通鲤鱼及其变种。1998年首次从美国和以色列的患病鲤鱼和锦鲤中分离出来并被证实。2001年香港首次爆发该疾病，最近已入侵了东南亚许多国家的初始种群。KHVD在2006年被世界动物卫生组织（OIE）列为必需报告的疾病［1］，但由于其发展史较短，有关KHVD的病原体、诊断方法及相关防疫措施的研究相对较少。本文就KHVD的研究进展进行了综述，以期为锦鲤疱疹病毒病的后续研究提供参考。

1 病原体--KHV

1.1 KHV的分类和命名 最初由于KHVD临床症状主要是肾脏出血红肿和鳃坏死病变，被称为鲤鱼间质性肾炎和鳃坏死病毒（CNGV），后最终被命名为锦鲤疱疹病毒（KHV）［2］。KHV为疱疹病毒科（Herpesviridae），鲤疱疹病毒属（Cyprinid herpesvirus），又称鲤疱疹病毒3型（CyHV-3），与鲤痘疮病毒（鲤疱疹病毒1型，CyHV-1）和金鱼造血器官坏死病毒（鲤疱疹病毒2型，CyHV-2）同属。KHV形态特征与其他两种鱼类疱疹病毒类似，但在临床症状、宿主范围、抗原性、生长特性和细胞病变类型等方面不同于二者［3］。

1.2 KHV分子生物学特性 KHV属于疱疹病毒目（Herpesvirales）中的鱼类疱疹病毒科（Alloherpesviri⁃dae）［4］，是一种较大的线性、双链DNA病毒，基因组大小为295 kb，末端含有22个正向重复序列，共有156个开放性阅读框（ORF）和8个末端重复序列，GC含量占全部核苷酸的59.2%。成熟的病毒粒子呈球形，直径约为170～230 nm，主要由囊膜，皮层，衣壳，核心组成。核衣壳是直径为110 nm左右的二十面体对称结构，外有囊膜结构包裹。病毒核表面有螺纹结构，核内有一不对称的电子致密区域，被认为是病毒基因组组成的核蛋白［5］。

1.3 KHV基因组结构的研究进展 目前，对KHV的主要基因型已经确定，其全基因组的结构及编码蛋白的功能的研究较为滞后。仅个别较保守的ORF的功能已经确定，并被成功克隆。

1.3.1 结构蛋白 2010年，Michel B等人利用质谱的方法已确定KHV成熟病毒粒子由40种蛋白质组成，包括3个核衣壳蛋白（ORF72、ORF78、ORF92）、13个囊膜蛋白（ORF25、ORF32、ORF59、ORF65、ORF81、ORF99、ORF108、ORF115、ORF131、ORF132、ORF136、ORF148、ORF149）、2个间质蛋白（ORF62、ORF132）以及22个未分类蛋白［5］。但是只有个别基因经过试验验证其功能。2012年，李新伟克隆出编码膜糖蛋白的ORF25和囊膜蛋白ORF81基因，并成功构建核酸疫苗［6］。ORF25表达蛋白存在于细胞质中，是KHV的主要结构蛋白，具有良好免疫原性［7］。ORF81［8］基因表达囊膜蛋白，含有四个跨膜区域，参与病毒与细胞融合及病毒对细胞的吸附、穿入和释放。

1.3.2 非结构蛋白 根据蛋白质功能预测可分为5个家族：ORF2家族、TNFR（肿瘤坏死因子受体）家族、ORF22家族、ORF25家族和Ring家族。ORF2家族包括ORF2和ORF9，其中ORF2［9］基因表达膜蛋白。TNFR家族包括ORF4和ORF12。TNFR家族的两个基因（ORF4／12）编码的蛋白具有TNFRmotif.ORF25家族编码6个膜蛋白（ORF25［6-7］、ORF26、ORF27、ORF65［7］，ORF148和ORF149）；RING家族共编码四个蛋白（ORF41、ORF128、ORF144、ORF150）均含有锌指结构（RING Finger）特征基序。

KHV的主要毒力基因可能为TK基因［10］，对应ORF55，编码胸腺嘧啶脱氧核苷激酶。其功能为催化脱氧胸腺嘧啶核苷酸化成dTMP，并进一步磷酸化为dTTP，即组成DNA分子的基本成分，此外也间接参与dCTP、dGTP和dATP等物质的合成。与病毒在宿主体内保持潜伏感染状态以及激活潜伏感染状态密切相关，具有关键性的作用。

KHV的免疫原性蛋白5个［11］，分别为ORF56、ORF150、ORF92、ORF22和ORF23.其中ORF56为糖蛋白，ORF150为RING家族脂蛋白，ORF92为主要衣壳蛋白，ORF22为膜蛋白，ORF23编码白介素-10。这些免疫调节基因是保守的，并且可以在逃避宿主免疫系统的病毒的能力中起重要作用。

2 KHVD流行病学特征

KHV感染造成锦鲤和普通鲤鱼的重大死亡。这种疾病早前在以色列被称为鲤鱼间质性肾炎和鳃坏死的疾病（CNGV）。锦鲤疱疹病毒首次于1998年在以色列和德国爆发。随后在美国、英格兰和荷兰爆发被报道［1］。2002年，首次在中国广东省发现该病［12］。2011年，朱霞等利用框镜鲤鱼鳍细胞（KFC）从我国辽宁省某养殖的患病锦鲤分离得到该病毒［13］。如今KHVD现已蔓延到大多数大洲，至今为止，超过30多个国家或地区爆发该病，包括以色列、英国、德国、美国南非、波兰［14］、捷克共和国［15］、日本［16］、澳大利亚、韩国［17］、马来西亚、中国［18］、加拿大［9］、俄罗斯［20］、新加坡以及印度等。

KHVD感染宿主的范围比较窄，目前只发现易感染锦鲤、鲤鱼及其变种鱼。幼鱼与成鱼均易感染。一般疾病的潜伏期5～7 d，特点是当水温在15～25℃范围内，突然发病，迅速蔓延［21］。KHVD发病最适温度为20～25℃，30℃以上病毒会处于休眠状态，最新研究发现KHV可以在冰下繁殖，发病时水温为-2～5℃，平均3℃［22］。KHV爆发后幸存的鱼带毒，可将疾病传染给其他鱼。

3 KHVD临床症状

感染KHV后的锦鲤或鲤鱼的临床症状与病程有关，处于不同时期的患病鱼的症状有差异。在感染初期，体表有少量出血点和白斑，鳞片松动，脱落并带有血丝；肛门略微红肿；眼凹陷，眼底出血；鳍条充血，尾鳍最为严重，臀鳍和背鳍次之；皮下和肌肉出血；打开鳃盖，鳃丝呈深红色，减去一条全鳃，血流量减少且凝固迅速；肠道充血发红且硬挺，肾肿大颜色发红，脾脏有出血点，胆汁的颜色较深。感染中后期出现精神抑郁，行动迟缓且无方向感的游泳或停止游泳，皮肤出血及出现白斑和水泡，鳍条上有血丝，鳃盖和鳃丝出血并产生大量粘液，患病鱼在1～2 d内死亡。KHV发病时，出现发病急，感染率和死亡率高等特点，且容易死亡的常是体态肥硕的［3］。

4 检测方法研究进展

由于KHV传播快，感染率和死亡率高，潜伏时间长，所以需要研究出能快速准确的诊断KHV的办法以便对鱼群及时有效的处理从而控制KHV的传播。通过常规的临床诊断不能对锦鲤疱疹病毒病进行确诊，还需结合试验技术诊断方法。迄今为止，许多技术已被用于鱼锦鲤疱疹病毒的检测［23］。目前主要的诊断方法有细胞分离培养检测、血清中和试验和分子生物学检测。

4.1 细胞分离培养 该病毒可在易感的鱼类细胞分离，如KFC、KF-1、KT-2或CCB的细胞株。目前，国内KHV细胞分离培养技术已经相当成熟。2011年，中国中山大学何建国等人建立了一种鲤鱼鳍条细胞系KCF-1，并成功分离得到了KHV［24］。同一年，吉林农业大学朱霞等人也成功的分离得到了KHV［25］。

4.2 分子生物学诊断方法

4.2.1 PCR技术 PCR是KHV检测的一种更具体和敏感的方法，Nested-PCR［13］、实时PCR［26］、荧光定量PCR［27］已经开发使用于锦鲤疱疹病毒的检测。由于KHV含有内含子，所以设计跨越内含子区域的引物，使用RT-PCR［28］方法也可以准确的鉴定该疾病。但是PCR方法不能用于活鱼检测。

4.2.2 环介导等温扩增（LAMP） 经过不断地改良，LAMP法的敏感度和特异性越来越高。最近，Wen-Hsin等［29］建立了一个在集成微流体系中，运用LAMP法快速分离和检测水产病原的工具。该工具可以在65 min内完成样品前处理，LAMP程序及光学检测的全过程，可以同时检测四种病原体。因此，LAMP在未来可能成为快速检测KHV的有力工具。

除了上述方法外还有ELISA方法、电镜技术及原位杂交技术等。ELISA方法是一种间接诊断方法，可以通过检测锦鲤和鲤鱼血清中抗KHV抗体来诊断。但是，ELISA方法检测KHV的背景值高，与CCV和CHV之间具有较高的交叉免疫反应。另外，鱼类的血清抗体水平较低，不易检出，因此ELISA的应用受到了一定的限制。电镜技术及原位杂交技术所需要仪器设备非常昂贵，不适宜推广应用。

5 防控措施

KHVD给世界各地的鲤鱼和锦鲤养殖业都造成了严重的经济损失，而且一旦爆发，病情很难控制。及时采取有效的预防措施是控制该病的主要途径。

5.1 免疫预防 防制病毒性传染病的有效方法是疫苗免疫。目前减毒疫苗、灭活苗、核酸疫苗已经投入使用。减毒疫苗对鱼的免疫保护作用可维持至少8个月，目前已经商业化生产。灭活苗还没有商业化生产。

由于灭活疫苗和减毒疫苗在稳定性、成本及保护率方面还有许多缺点，所以核酸疫苗应运而生，通常通过克隆KHV某段序列并构建真核表达重组质粒，然后免疫试验动物而获得的特异性抗体。灭活疫苗和减毒疫苗无法诱导机体产生细胞免疫。而核酸疫苗不仅可以诱导机体产生细胞免疫，且保护力持续时间较长。到现在为止，仍没有可靠地核酸疫苗产生。Fuchs等［30］人生产的具有删除病毒核糖核苷酸还原酶（RNR）、胸苷激酶（TK）、尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶（dUTPase）、或删除TK和dUTP基因的重组KHV。所有的病毒突变株在培养细胞中均有复制能力，但TK或dUTP缺失株空斑变小，滴度降低，对鲤鱼感染力衰减。所以构建的TK或dUTP缺失株对于KHV的防控有很大的借鉴意义，可以进一步研究KHV基因缺失疫苗。

5.2 其他防控方法 有研究［31］认为，KHVD的流行是季节性水温变化导致的，由此提出爆发的控制可以通过控制养殖中的水温来实现，还可以通过筛选对KHV有抵抗力的杂交种和品系来降低由KHVD造成的损失，但该方法不适用于筛选有KHV抗性的观赏锦鲤。

6 展望

当前，KHVD已经严重的威胁到了鲤鱼养殖业，关于KHVD急需多方面深入研究，如生物学及分子生物学的深入研究、基因组每个基因功能的确定、诊断方法的研究、敏感细胞系的建立和研制有效的疫苗等。

目前，在我国关于KHVD爆发的报道并不多见。但是我们必须提高警惕，尽快建立特异、敏感、快速、适宜现场诊断的方法，加强进出口口岸检疫，控制KHVD在国内的传播，避免KHVD对鲤鱼养殖业造成巨大损失。

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（编辑：李文平）

Research Progress of Koi Herpesvirus Disease

YUAN Hai-yan，YU Hui，WANG Hao，ZHOU Jing-xiang∗，ZHANG Rui-xue，LIU Jian-ping，MA Yue，WANG Zhao
（Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

The achievements of etiology，epidemiological characteristics，clinical symptoms，detection method，the prevention and control technology for the koi herpesvirus disease were summarized to provide a reference for research and prevention of koi herpesvirus disease.

koi herpesvirus；molecular biology；detection method；prevention and control technology

2015-01-16

A

1002-1280（2015）05-0062-04

S943

袁海延，硕士研究生，从事动物病毒分子生物学研究。

周井祥。E-mail：zhjxnd＠126.com