周芳玉，王春凤，杨桂连

(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林省动物微生态制剂工程研究中心，长春130118)



柔嫩艾美耳球虫保护性抗原应用研究进展

周芳玉，王春凤，杨桂连*

(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林省动物微生态制剂工程研究中心，长春130118)

鸡球虫病是一种重要的鸡寄生虫病，长期以来药物防治成为抗球虫病的主要手段，但由于药物的残留和耐药性等问题，使得鸡球虫病的免疫学研究受到广泛关注。本文对柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段重要的免疫保护性抗原研究进行了综述，旨在为鸡球虫病的免疫防治提供新思路和参考。

鸡球虫病；保护性抗原；免疫防治

鸡球虫病是一种严重危害养鸡业的寄生虫病，主要是由艾美耳属的9种球虫引起。鸡只感染后导致大量肠上皮细胞受损而出血,产生血便,导致体重下降，饲料吸收率降低，严重时造成鸡只大量死亡，给养鸡业带来不可估量的损失[1]。目前鸡球虫病主要以化学药物防治为主，但由于存在药物耐受和残留问题，其应用受到限制。由于疫苗防治鸡球虫病具有潜在的优越性，越来越多的研究人员将研究目标转移到了疫苗的研制。通过免疫蛋白组学方法，从基因水平向蛋白质水平的深化，发现更多新的具有较强免疫原性和免疫保护性的球虫保护性抗原，为球虫疫苗今后发展的方向。本文对近年来鸡球虫保护性抗原在球虫病免疫防治中的应用进行综述，旨在为鸡球虫免疫预防提供参考。

1 柔嫩艾美耳球虫不同阶段的保护性抗原蛋白

相关研究人员采用免疫蛋白组学方法对柔嫩艾美耳球虫生活史中三个不同阶段的可刺激宿主产生抗体的蛋白分别进行了筛选，以期发现新的免疫保护性蛋白[2]。

1.1 未孢子化卵囊中的保护性抗原蛋白 相关研究人员通过免疫蛋白组学在球虫未孢子化卵囊中发现14种柔嫩艾美耳球虫已知蛋白，这些蛋白包括乳酸脱氢酶、烯醇酶、肌动蛋白解聚因子、免疫球蛋白重链结合蛋白、丙酮酸激酶、β微管蛋白、柔嫩艾美耳球虫假定蛋白、子孢子抗原等[2-3]。

1.2 孢子化卵囊中的保护性抗原蛋白 采用蛋白质组学方法在柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊中发现22种柔嫩艾美耳球虫已知蛋白，包括乳酸脱氢酶、烯醇酶、14-3-3蛋白、微线蛋白、微管蛋白、子孢子抗原、表面抗原10、微线蛋白3、柔嫩艾美耳球虫未知蛋白、烯醇酰基还原酶和转氢酶等[2-3]。

1.3 柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中的保护性抗原蛋白 同样采用蛋白质组学方法在柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中发现26种柔嫩艾美耳球虫已知蛋白包括乳酸脱氢酶、烯醇酶、14-3-3蛋白、微线蛋白、微管蛋白、表面抗原等[4-5]。

2 柔嫩艾美耳球虫几种主要免疫保护性抗原蛋白的应用

通过对柔嫩艾美耳球虫三个不同阶段的免疫保护性抗原蛋白的分析，发现其中几种蛋白在抗球虫病方面具有重要的研究价值。主要包括微线蛋白、棒状蛋白、折光体蛋白、表面抗原、子孢子抗原、菱形蛋白、乳酸脱氢酶等。

2.1 微线蛋白(Microneme Protein,MIC) 顶复门寄生虫的微线蛋白多数由与高等真核细胞黏附蛋白高度同源的系列调节基序组成，如Ⅰ型凝血酶致敏蛋白重复域(Thrombospondin Type ⅠLike Repeats,TRS)，表皮生长因子重复域(Epidermal Growth Factor Repeats，EGF)，血管性血友病因子A(von Willibrand Factor Type A Domain,vWA)，半乳糖凝集素和苹果结构域(Apple/PAN domains)，球虫大部分的MIC蛋白能够与宿主细胞的葡聚糖特异性结合并建立顶端元件。MIC蛋白表达多变结构域能够黏附宿主细胞低聚糖表位，在球虫入侵宿主细胞过程中起到关键作用。MIC蛋白多以多价异聚体复合物形式存在，先由内质网合成，然后运送到微线体。每个微线体蛋白复合物有一个“护卫蛋白”能让微线体复合物与滑动体相互作用[6]。目前MIC蛋白被广泛用于抗球虫病研究中且具有一定的免疫保护性作用。张杰等[7]从SD-01株柔嫩艾美耳球虫的第二代裂殖子总RNA中扩增并克隆了EtMIC2基因，并进一步构建真核表达载体pPIC9-EtMIC2和原核表达载体PET30a-EtMIC2，将阳性重组质粒分别转染毕赤酵母和大肠杆菌，使用巴斯德毕赤酵母表达系统和大肠杆菌分别表达了EtMIC2蛋白，并对雏鸡进行免疫，两组免疫组的雏鸡体重增长量与对照组相比均获得了较大提高，毕赤酵母和大肠杆菌表达的EtMIC2蛋白质都表现出良好的免疫原性，细胞因子和抗体水平显著提高。

2.2 顶膜抗原(Apical Membrane Antigen,AMA) AMA最初在疟疾寄生虫恶性疟原虫中发现，是一个高度保守的抗原蛋白。AMA是由微线体分泌Ⅰ型跨膜蛋白，由胞质区、跨膜区、胞外区组成。E.tenella的基因组中有三个AMA的编码序列，分别是AMA1 , AMA2, AMA3。AMA1存在于E.tenella子孢子表面，2012年Jiang等[8]人应用表达序列标签技术(Expressed Sequence Tag,EST) 鉴定了E.terrellaAMA1的cDNA全长，基因全长1608 bp,含有一个开放阅读框，编码535个氨基酸，蛋白分子量为58 kDa,实时荧光定量PCR的结果表明，AMAl在子孢子阶段的表达水平要高于未孢子化的卵囊、孢子化卵囊和第二代裂殖子，AMA1在E.tenella的入侵和发育中起着重要的作用[9]。Blake等[10]利用基因图谱法对球虫中免疫力最强的巨型艾美耳球虫保护性抗原进行筛选，将两株具有不同生物学特性的巨型艾美耳球虫在鸡体内进行杂交后的基因组，与柔嫩艾美耳球虫的基因组进行比对，结果发现与AMA 1具有同源性的抗原可以优先刺激机体产生免疫力，可以优先作为疫苗和药物开发的研究靶标。

2.3 棒状蛋白(Rhoptry Protein) 棒状体是球虫体内棒状的细胞器，能够分泌俩种不同的蛋白一种是与寄生虫早期入侵相关的蛋白，为棒状体颈部区域蛋白(Rhoptry Neck Proteins, RONs)，一种是分泌较晚的棒状体球状区域蛋白(Rhoptry Proteins, ROPs)，参与带虫空泡的形成，改变虫泡的内环境，并与宿主细胞的信号转导通路相互作用，辅助虫体的入侵[11]。ROP蛋白分泌的确切机制还不清楚。有学者提出通过膜结合MIC复合物的胞质尾触发分泌信号，此复合物能与宿主细胞受体作用。棒状体颈部区域蛋白(RONs)在入侵早期分泌，对于MJ[12](移动连接)的形成和维持至关重要。而棒状体球状区域蛋白(ROPs)分泌的稍晚，虫泡形成后RONs与AMAI相互作用，引发ROPs的释放。Aikawa等人经试验证实MJ是虫体的重要结构，能够起到锚定虫体的作用，继而产生推力让寄生虫向前运动进入寄生泡。由微线体分泌到寄生虫表面的跨膜蛋白AMA1与RONs作用能够启动MJ的形成，寄生虫通过AMA1锚定在宿主细胞表面，RONs复合物分泌入宿主细胞，然后RON2插入到宿主细胞膜。AMA1和RON蛋白在艾美尔球虫中是保守的，表明MJ的形成机制可能也是保守的[13]。王晔等成功构建了EtRON2的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2,并在真核细胞中获得表达，为深入研究EtRON2的生物学功能和研制球虫DNA疫苗奠定了基础[14]。

2.4 球虫表面蛋白(Surface Antigen，SAGs) 艾美尔球虫子孢子和裂殖子表面有一层糖基磷脂酰基醇(GPI)此蛋白可作为表面抗原(Surface Antigen，SAGs)。有研究表明E.tenella的SAGs能够黏附多种培养细胞，证明这些蛋白参与最初的非特异性黏附阶段[15]。最近的研究表明，E.tenella表达多达80种不同的SAG蛋白，并已证实这些蛋白在球虫生命周期中的调节是有差异的，如第二代裂殖子SAGS表面复合物要比子孢子和第一代裂殖子中多[16]。SAGS能有效的诱导机体产生免疫反应，阻止子孢子入侵细胞。一项研究10种E.tenella子孢子SAGs的试验表明，其中三种能够增加鸡巨噬细胞中一氧化氮的产量，提高IL-1β，IL-10的转录水平，并能降IL-12 IFN-γ转录水平[17]。这表明至少有部分的SAGs能够调节鸡的天然免疫和获得性免疫反应，并刺激细胞免疫，同时有促进炎症反应，并能在E.tenella感染期间观察到病理学变化[18-19]。3-lE基因是众多表面抗原中的一员，Lillehoj等人用重组的E.acervulina 3-1 E蛋白作为抗原能够引起机体的免疫应答，刺激淋巴细胞增殖，诱导机体产生I FN-γ，减少鸡球虫卵囊的排出量[20]。余东游等构建表达3-1E抗原基因的重组枯草芽孢杆菌作为活载体疫苗对肉鸡进行免疫，结果表明该活载体疫苗对肉鸡抵抗柔嫩艾美耳球虫感染具有显著的生理保护效果[21]。张艳等[22]构建了重组表达载体pGEX-3-1E,并将其转化入大肠杆菌BL21中，提取质粒经酶切PCR鉴定后，用IPTG诱导表达。表达产物经Western blot检测显示，3-1E基因在大肠杆菌中成功表达，为3-1E基因的原核表达提供了依据。

2.5 菱形蛋白(Rhomboid Protein) Rhomboid蛋白自发现以来一直吸引着研究者的注意。研究表明Rhomboid蛋白存在球虫发育阶段的各个时期，而以未孢子化阶段转录水平最低。作为一类膜内的丝氨酸蛋白酶，它参与着表皮生长因子及表皮生长因子受体信号的转导。近年来人们在很多顶器门的原虫体内也发现了Rhomboid蛋白的存在，其中包括柔嫩艾美耳球虫。经过对弓形虫和疟原虫Rhomboid蛋白的鉴定，发现Rhomboid蛋白水解其底物MIC蛋白是虫体侵入宿主细胞的关键过程[23]。张西臣等通过酵母双杂交系统研究了俩种蛋白间的相互作用。将含有Rhomboid蛋白、MIC4蛋白以及互作蛋白的酵母细胞AH109破碎后免疫雏鸡，从而进行攻虫试验，观察酵母细胞中具有互相作用的两种蛋白对柔嫩艾美耳球虫的动物保护性。结果说明，通过体液免疫水平和细胞免疫水平的检测，各实验组与对照组相比差异均显著(P<0.05 )，其中含有两种互作蛋白的实验组差异极显著(P<0.01);攻虫试验结果显示其ACI可以达到168.24;同时试验结果首次表明酵母细胞也能够产生一定的免疫保护作用[24]。

2.6 乳酸脱氢酶(LactatedehydrogenaseLDH) 球虫乳酸脱氢酶(LactatedehydrogenaseLDH)被认为是一种很有潜力的疫苗候选抗原。LDH是一种广泛分布于微生物、植物和动物细胞内的重要功能酶，是糖酵解途径的关键酶之一。大多数体内寄生虫的能量来源于无氧糖酵解，LDH是该途径的终端酶，所以，LDH对于寄生虫生命活动的正常进行至关重要。目前，国内外关于寄生虫LDH的研究主要集中在疟原虫、弓形虫等[25]。研究LDH对于促进寄生虫病诊断抗原和疫苗研究以及新抗虫药物的研发有重要的意义。已有研究表明，每种鸡球虫仅有一种LDH，堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫LDH氨基酸序列的同源性为66%～80%，其蛋白在卵囊、子孢子、裂殖体和裂殖子阶段的表达水平相当，被认为是一种很有潜力的疫苗候选抗原[26]。王艳歌[27]等构建了重组EtLDH蛋白的真核表达质粒pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ，并转染到293T细胞中，通过免疫印迹和间接免疫荧光的方法证实EtLDH基因在真核细胞中成功表达，为进一步研究该蛋白的生物学功能和研制球虫DNA疫苗奠定了基础。

2.7 折光体蛋白(FoldingbodyProtein) 球虫子孢子及第一代裂殖体阶段都含有折光体，子孢子侵入宿主细胞后，体内的前后两个折光体发生融合, 在球虫裂殖生殖阶段,融合体又逐渐发生分裂,但在第一代裂殖生殖之后逐渐消失。因此，有人推测折光体内可能储存着子孢子通过肠道及细胞内发育前几小时所需要的营养物质，这可能与虫体的入侵有关。第一个报道的折光体蛋白为GX3262 (亦称EtS07 ), 可用多克隆的高免鸡血清在E.tenella的cDNA文库中鉴定出来，用其表达的蛋白免疫鸡后，可使盲肠球虫的病变值下降50%。S07编码的抗原可作为鸡球虫基因工程疫苗的候选之一。杨智勇[28]通过构建pSIP409-SO7-IL2重组乳酸菌免疫雏鸡，测定免疫后各项指标，综合各项数据结果发现重组菌具有优秀的保护效力。从而证明了S07表达产物能诱导鸡产生对E.tenella的保护作用。

3 展望

近年来鸡球虫保护性抗原蛋白的研究发展迅速，逐步有新的具有免疫原性的球虫抗原被应用，球虫保护性抗原的研究也为鸡球虫病免疫预防提供了重要的方向。但这些疫苗尚处在试验研究阶段，还有一些瓶颈技术有待解决，例如载体的优化，球虫保护性抗原基因的筛选，蛋白质如何高效表达，只能诱发对球虫病的部分保护等。其中主要原因在于部分保护性抗原只是球虫发育过程中某一阶段的抗原，而球虫生活史复杂，基因组庞大，其保护性抗原又存在种间差异，因此筛选高度保守性共同抗原，研制多价联合疫苗不失为一种好的方法。另外对表达质粒载体的优化应寻找合适的酶切位点，从而提高质粒的稳定性。研究表明重组蛋白胞外表达可以防止胞内蛋白酶的降解，所以在实验研究中可以运用表面展示元件使目的蛋白表达在细胞表面从而促进蛋白胞外分泌。相信随着分子生物学和基因工程技术的发展和球虫免疫学以及蛋白组学研究的不断深入，以上问题都会逐步得到解决，球虫保护性抗原的应用也会更加的广泛，更多的保护性抗原也会被应用到球虫免疫当中。

[1] 黄小丹.鸡IL-18堆型艾美耳球虫3-1E-a-tubulin增强型核酸疫苗免疫保护机理[D].哈尔滨：东北农业大学,2012.

[2] Shirley Martin W, Ivens Al, Gruber Arthur,etal. The Eimeria genome projects: a sequence of events[J]. Trends in parasitology, 2004, 20(5):199-201.

[3] de Venevelles P, Chich J F, Faigle W,etal.Towards a reference map of Eimeria tenella sporozoite proteins by two - dimensional electrophoresis and mass spectrometry[J]. International journal for parasitology, 2004, 34(12):1321-1331.

[4] de Venevelles P, François Chich J, Faigle W,etal. Study of proteins associated with the Eimeria tenella refractile body by a proteomic approach[J]. International journal for parasitology, 2006, 36(13):1399-1407.

[5] 刘文江，黄兵，欧阳五庆，等.柔嫩艾美球虫抗药株第二代裂殖子的双向电泳图谱比较[J].中国兽医科技，2004，34(3):21-25.

[6] Jewett Travis J, Sibley L David. Aldolase forms a bridge between cell surface adhesins and the actin cytoskeleton in apicomplexan parasites[J]. Molecular cell, 2003, 11(4):885-894.

[7] 孙慧,刘 卿,张杰,等.柔嫩艾美耳球虫EtMIC2的酵母表面展示[J].兽医大学学报, 2014, (2):231-235.

[8] Lianlian Jiang, Jiaojiao Lin, Hongyu Han,etal.Identification and characterization ofEimeriatenellaapical membrane antigen - 1 ( AMA 1 )[J]. PloS one, 2012, 7(7):e 41115.

[9] 戚南山,孙铭飞,廖申权,等.顶复门原虫入侵相关因子的研究进展[J].畜牧兽医学报, 2012, 43(2):167-174.

[10]Santos Joana M, Ferguson David J P, Blackman Michael J,etal.Intramembrane cleavage of AMA 1 triggers Toxoplasma to switch from an invasive to a replicative mode[J]. Science (New York, N.Y.), 2011, 331(6016): 473-477.

[11]Richard D Oakes, Dominic Kurian, Elizabeth Bromley,etal.The rhoptry proteome ofEimeriatenellasporozoites[J].International journal for parasitology，2013,43(2):181-188.

[12]Besteiro Sébastien, Dubremetz Jean - François, Lebrun Maryse. The moving junction of apicomplexan parasites: a key structure for invasion[J]. Cellular microbiology, 2011, 13(6):797-805.

[13]Damer P. Blake, Halimah Alias, Karen J. Billington,etal.EmaxDB: Availability of a first draft genome sequence for the apicomplexan Eimeria maxima [J].Molecular & Biochemical Parasitology, 2012, 184(1):48-51.

[14]王晔,姜连连,韩红玉,等.柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2基因真核表达载体的构建及在293T细胞中表达[J].中国动物传染病学报, 2012, 20(5):39-44.

[15]del Cacho Emilio, Gallego Margarita, Sá nchez-Acedo Caridad,etal. Expression of flotillin-1 onEimeriatenellasporozoites and its role in host cell invasion[J]. The Journal of parasitology, 2007, 93(2): 328-332.

[16]Lal Kalpana, Bromley Elizabeth, Oakes Richard,etal.Proteomic comparison of fourEimeriatenellalife-cycle stages: unsporulated oocyst, sporulated oocyst, sporozoite and second-generation merozoite[J].Proteomics, 2009, 9(19):4566-4576.

[17]Chow Y P, Wan K L, Blake D P.ImmunogenicEimeriatenellaglycosylphosphatidy linositol-anchored surface antigens(SAGs) induce inflammatory responses in avian macrophages [J].PIoS one, 2011, 6(9):2523.

[18]Howe Daniel K, Gaji Rajshekhar Y, Mroz-Barrett Meaghan,etal.Sarcocystis neurona merozoites express a family of immunogenic surface antigens that are orthologues of the Toxoplasma gondii surface antigens ( SAGs ) and SAG-related sequences[J].Infection and immunity, 2005, 73(2):1023-1033.

[19]郭衍冰,曹利利,姚新华,等.柔嫩艾美耳球虫SAG2基因重组卡介苗的抗球虫保护效果[J].吉林畜牧兽医,2015,(2):22-25.

[20]Lillehoj H S, Choi K D, Jenkins M C,etal. A recombinant Eimeria protein inducing interferon-gamma production : comparison of different gene expression systems and immunization strategies for vaccination against coccidiosis[J]. Avian diseases, 2000, 44(2):379-389.

[21]余东游,史艳云,邓斌,等.柔嫩艾美耳球虫3-1E基因工程活载体疫苗对肉鸡的保护效果[J].中国兽医学报,2014,34(3):431-435.

[22]张艳,刘海隆,曹宗喜,等.鸡柔嫩艾美耳球虫HN株3-1E基因的原核表达与鉴定[J].畜牧与兽医,2015,47(1):33-36.

[23]Jun Zheng, Pengtao Gong, Honglin Jia,etal.Eimeriatenellarhomboid 3 has a potential role in microneme protein cleavage[J].Veterinary Parasitology, 2014, 201:146-149.

[24]Zheng Jun, Li Jianhua, Wang Qiuyue,etal.Sequence analysis and verification ofEimeriatenellarhomboid bait plasmid suitability for CytoTrap yeast two-hybrid system[J]. Parasitology research, 2011, 108(2):253-259.

[25]Al-Anouti Fatme, Tomavo Stanislas, Parmley Stephen,etal. The expression of lactate dehydrogenase is important for the cell cycle of Toxoplasma gondii[J].The Journal of biological chemistry,2004,279(50):52300-52311.

[26]王艳歌,董辉,黄兵.寄生虫乳酸脱氢酶研究进展[J].中国动物传染病学报,2014,22(1):80-86.

[27]王艳歌，董辉，韩红玉，等.柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶真核表达质粒的构建与鉴定[J].中国动物传染病学报, 2014, 22(2):65-71.

[28]杨智勇.柔嫩艾美耳球虫SO7基因重组乳酸菌的构建及保护性效果研究[D].长春：吉林农业大学，2014.

(编辑：侯向辉)

Progress ofE.tenellaProtective Antigen

ZHOU Fang-yu, WANG Chun-feng, YANG Gui-lian*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,JilinProvincialEngineeringResearchCenterofAnimalProbiotics,Changchun130118,China)

Chicken coccidiosis is an important parasitic disease of chicken. For a long time drug control becomes the main means of against coccidiosis. But due to drug residue and drug resistance issues, making chicken coccidiosis immunology research attracts a wide spread attention.This paper describes the different developmental stages of research ofE.tenella’s important protective antigen and aims to provide new ideas and references for the prevention and immunity of chicken coccidiosis.

coccidiosis；protective antigen；immune prevention

国家863计划项目(2013AA102806, 2011AA10A215); 国家自然科学基金项目(31272552， 31272541)； 吉林省科技发展计划项目(20111816)

周芳玉，在读硕士生，从事动物寄生虫免疫学研究。

杨桂连。E-mail：yangguilian@jlau.edu.cn

2015-07-17

A

1002-1280 (2015) 09-0065-05

S852.43