祖立闯，李 娇，张 倩，庄金秋，李 峰，沈志强，

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.黄岛出入境检验检疫局，山东 青岛 266555；3.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

反向遗传技术及其在猪病防控研究中的应用

祖立闯1，李 娇1，张 倩2，庄金秋3，李 峰3，沈志强1，3

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.黄岛出入境检验检疫局，山东 青岛 266555；3.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

反向遗传技术与经典的从表型改变到进行基因特征研究的思路相反，是指通过在体外构建病毒的感染性cDNA克隆，通过病毒拯救获得低毒力的弱毒株，并且新毒株的免疫原性保留，可以作为弱毒疫苗而广泛应用到猪病防控中，将是未来新型猪病疫苗研究的发展方向。文章针对反向遗传技术在猪病防控中的研究概况作一简要综述，以期为加强我国新型疫苗研究开发和提高我国猪病防控能力提供参考。

反向遗传技术；猪病防控；应用

近年来，随着我国养猪业的现代化、规模化快速发展，以疫苗免疫接种为主的动物疫病防控体系亦得到不断完善，但在临床中日益表现出温和型和非典型病变，给猪病的综合防控提出了新的挑战。故加强新型疫苗尤其是基因标记疫苗的研究日益得到重视，反向遗传操作技术能够利用生物信息学技术对微生物基因组序列进行分析，在对靶基因进行必要的定点突变和基因置换等加工和修饰后，再按组成顺序构建和装配出具有生命活性的个体。与传统疫苗相比，反向遗传技术构建的新型疫苗株具有减毒途径明确、效率高、毒力回复率低的优势，并且能够通过标记基因实现与野毒株的鉴别诊断。随着基因组学、生物信息学和分子生物学技术的快速发展与应用，近几年反向遗传技术在猪病方面的研究亦得到不断发展和深入，本文针对反向遗传技术在猪病防控中的研究概况作一简要综述，以期为加强我国新型疫苗研究开发和提高我国猪病防控能力提供参考。

1　动物病毒的反向遗传系统

动物病毒的反向遗传操作通过感染性克隆的构建，可以进一步了解病毒的基因和功能，阐明病毒的起源和致病机制，开发新型疫苗及病毒载体疫苗。突破了对单一基因研究的局限，从病毒整体与分子之间、病毒与宿主关系方面研究病毒的毒力和致病性。可以采取基因敲除、插入、置换或构建嵌合病毒等方法对病毒基因功能进行研究。目前动物病毒的反向遗传操作研究的手段主要包括以T7 RNA聚合酶为基础的病毒拯救系统、真核RNA聚合酶Ⅰ拯救系统、真核RNA聚合酶Ⅱ拯救系统、polⅠ-polⅡ双启动子拯救系统。

2　几种主要猪病的反向遗传操作系统

2.1猪流感病毒反向遗传操作系统

猪流感病毒反向遗传操作系统方面的研究比较多，国内孟沙沙等［1］分别构建了H1N1亚型猪流感病毒JS40株8个基因节段的重组质粒，经转染293T和MDCK混合细胞，拯救出病毒R-JS40株，序列测定结果表明，救获病毒与亲本病毒的核苷酸序列一致，无氨基酸变异，可以稳定传代，抗原性未发生变化，对小鼠的致病性结果显示R-JS40与JS40对小鼠的组织嗜性以及在肺脏中复制的病毒滴度基本一致，表明R-JS40保持了亲本病毒JS40的生物学特性，该病毒反向遗传操作系统的建立，为进一步开展关于病毒的致病分子基础以及新型疫苗的研制提供有效的技术平台。黄梦等［2］利用RT-PCR技术扩增猪流感病毒A/swine/ Shanghai/1/07株H1N2的8个基因片段，分别克隆至双向转录表达载体PBD上，构建出8个能在哺乳细胞中复制和表达的质粒。将8个质粒共转染293T细胞，收取转染48 h时的细胞上清液并接种9～11日龄SPF鸡胚，成功拯救出有血凝活性的病毒。经序列测定，确定拯救病毒的8个基因片段均来自猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07株H1N2基因。H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础。同时，为H1N2亚型猪流感新型疫苗的研制开辟了新的途径。谭力凯等［3］通过试验构建了包含有GDK6毒株基因的8个重组质粒，转染293T细胞后成功拯救出病毒rGDK6。救获病毒与亲本病毒拥有相同基因序列，其抗原性、经HI试验、TCID50试验和小鼠攻毒试验表明，救获病毒的生物学特性与对小鼠的致病性与亲本病毒一致。禽源猪流感H6N6病毒的反向遗传系统的成功建立，为进一步研究H6亚型流感病毒的分子致病机理与病毒基因功能及新型疫苗创制提供了技术平台。

2.2猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作系统

徐彦召等［4］采用分子生物学方法改造pBluescriptIIsk（+）载体的多克隆位点并使其获得CMV启动子序列，在获得该病毒的全长cDNA克隆的基础上，采用酶切、连接、转化等方法将该病毒的全长cDNA置于CMV真核启动子序列的下游，获得含有CMV启动子和PRRSV XX-2012株全长cDNA克隆的重组质粒pSK-CMV-XX-2012。最后，将重组质粒直接转染Marc-145宿主细胞后，拯救出PRRSV XX-2012株。病毒生长特性试验结果显示，拯救病毒与亲本病毒在Marc-145细胞上具有相似的增殖特性，且拯救病毒序列含有不同于亲本病毒的分子标记（突变产生的MluI酶切位点），该研究建立了一种研究PRRSV反向遗传操作系统的简单、快速、节约时间和成本的方法。李燕华［5］等在已构建完成的高致病性PRRSV细胞传代毒株反向遗传系统（pAJXM）的基础上，将T 7启动子换成hCMV启动子，从而全长cDNA克隆不需经过体外转录成mRNA的过程，直接通过DNA转染Marc-145细胞拯救病毒，研究发现基于NDA转染的反向操作系统是可行的，并且hCMV启动子的TATA框与病毒基因组5′末端之间的碱基数目设置为25和在病毒基因组3′末端添加HDVr序列后，能够有效地提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率和稳定性。

2.3口蹄疫病毒反向遗传操作系统

口蹄疫病毒是一种高度接触性的烈性传染病，它有7种血清型，病毒基因组很容易发生变异，病毒的结构和功能尚未完全阐明，通过反向遗传技术可以研究病毒的结构和功能，通过体外构建病毒感染性分子克隆，研究病毒的复制与表达调控机理，研究病毒与宿主的相互关系［6］。Li S等［7］构建了亚洲1型口蹄疫病毒的感染性分子克隆，动物实验证明该克隆病毒的毒力与复制动力学与亲本病毒相似，该克隆病毒可以在BHK-21细胞中复制。克隆病毒缺少3A结构中91～104氨基酸，构建的缺少免疫表位的FMDV突变毒株可作为灭活疫苗候选毒株，为新型弱毒疫苗研究奠定基础。

2.4猪圆环病毒反向遗传操作系统

王伟丞［8］等参考GenBank中已发表的I型猪圆环病毒序列，设计1对特异性引物，通过PCR扩增PCV-1全长基因组序列，将其定向克隆至pcDNA3.1（+）真核表达载体中，对其进行PCR、双酶切鉴定及DNA序列测定，将构建好的重组质粒转染到PK-15细胞中，经3次连续传代，用PCR方法检测转染后盲传细胞中PCV-1核酸，经序列鉴定所拯救出的病毒与亲本病毒核苷酸同源性100%。结果表明所构建的PCV-1感染性克隆具有感染性。PCV-1反向遗传操作系统的成功建立为进一步研究PCV基因组的功能及新型疫苗的研发奠定基础。

3　反向遗传操作技术在动物新型疫苗研究中的应用前景

通过反向遗传操作技术在新型动物疫苗研究中的不断应用，可以寻找出与毒力相关位点，通过对毒力决定性基因的缺失或修饰得到一种无毒或减毒毒株，以此制备新型的减毒活疫苗。如缺失口蹄疫病毒细胞吸附位点的编码序列或前导蛋白酶的编码序列可得到口蹄疫病毒的减毒毒株，将其作成减毒活疫苗免疫动物可获得较好的免疫效果。另外还可以研制嵌合疫苗，开发多价疫苗。利用感染性克隆作为现有减毒活疫苗的种子批，可以减少生产批次间的差异，保持疫苗的稳定性和安全性。总之，反向遗传操作技术作为动物病毒病研究的一种新型方法，已经广泛应用到各种新型动物疫苗研究中。当前，国内外学者正在不断致力于各种新型高效疫苗的研发，反向遗传学的兴起，极大的推动了动物病毒疫苗研究的发展方向，为动物疾病的防控起到至关重要的作用。

［1］ 孟沙沙， 乔传玲， 陈艳， 等. 一株类禽型H1N1亚型猪流感病毒的反向遗传系统的建立［J］.中国预防兽医学报， 2013，35（2）： 91-94.

［2］ 黄梦， 于海， 周艳君， 等. H1N2 亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的建立［J］.中国动物传染病学报， 2011， 19（3）： 19-22.

［3］ 谭力凯， 张民泽， 邵振文， 等. 1 株禽源猪流感 H6N6 病毒的反向遗传系统的建立［J］.中国兽医杂志， 2014， 50（10）：6-8.

［4］ 徐彦召，王青，张慧辉，等. 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作系统的构建［J］. 中国兽医科学，2015，45（8）：794-801.

［5］ 李燕华，韦祖樟，谭菲菲，等. 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞传代毒株反向遗传系统的优化［J］.中国动物传染病学报，2010，18（3）： 13-20.

［6］ 任方，易忠，郭会玲，等. 口蹄疫病毒反向遗传技术研究进展［J］.动物医学进展，2014，35 （11）：84-87.

［7］ Li S， Gao M， Zhang R， et al. A mutant of Asial serotype of Foot-and-mouth disease virus with the deletion of an important antigenic epitope in the 3A protein［J］. Can J Microbiol， 2011， 57（3）：169-176.

［8］ 王伟丞，曾智勇，汤德元，等. 猪圆环病毒1型反向遗传操作系统的初步构建［J］. 黑龙江畜牧兽医，2014（9）：124-126.

2015-10-23）

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-06-022-15）

祖立闯（1981年5月-），男，汉族，黑龙江宾县人，助理研究员，硕士，主要从事兽用生物制品研究工作。 E-mail：zulichuang2008@126.com