李春明 （内蒙古锡林浩特市锡盟畜牧工作站 026000）

精子分离技术及在牛性别控制中的应用

李春明 （内蒙古锡林浩特市锡盟畜牧工作站 026000）

自人类驯化动物开始，人们就有控制动物后裔性别的愿望。无数的民间偏方被流传数千年，而首次成功只是大约30年前的事情，即从牛附植前胚胎组织采集细胞做核型分析，鉴定性别。近10年随着应用PCR技术的特效方法的发展，使快速和准确鉴定胚胎性别成为可能。但是，采取胚胎性别鉴定的路线要丢弃不希望性别的胚胎。另外，它还需要实施胚胎移植操作。然而，受精前的精子性别分离可克服这些不足。由于X精于和Y精子客观存在的物理、化学和免疫上的差异，引起许多研究者尝试去分离它们，但直到高分辨率的精子分拣技术问世前，并未取得明显进展。因而，精子性别分离技术的最新成果，提供了一个准确、高效和较少浪费的后裔性别先决的方法。

1 公牛精子流动分拣技术

依据DNA含量不同的精子流动分拣技术预选牛的性别，提供了一个预先决定犊牛性别的方法，其准确率为85～95%。这项性别分离技术采用细胞分拣仪，其工作原理是依据精子的DNA含量分离精子。带X染色体的精子，所含DNA比带Y染色体的精子约多4%。DNA含量的测定是用一种结合DNA的特异染料二苯并咪唑对采集的鲜精做活体染色。在精子与这种染料共培养1h后，当被染色的精子暴露在短波长光的激光束下时，发出明亮的蓝色荧光。被二苯并咪唑着色的X精子比Y精子发出较强的荧光，因为它的DNA含量较高。被染色的X精子和Y精子发出的荧光信号能被光电倍增管准确地检测到。当排成一列纵队而行的精子通过光电倍增管前时，它们发出的荧光信号被定量检测和经过计算机处理，可使大部分精子 （不是所有的）的DNA含量得到准确测量。只有位于适宜的方向时，精子的DNA含量才能被仪器准确测量，并且这个测定只是在含有精子的液流流出分拣仪的喷口时才发生。喷口自身以非常高的频率震动，以约l/90000s的速率形成一个微滴。这些含有精子的微滴具正电荷或负电荷，依检测仪得到的DNA含量信息而异。在没有精子时、多于一个精子或精子的DNA含量不能被准确地检测时，微滴不具电荷。死精子用另一种不透过膜的染料染色，从活的精子中分离出来，作为废物弃掉。这个用于精子性别分离的流动细胞分拣系统就是著名的SX MoFlo。具正电荷或负电荷的含有精子的微滴被冲有与精子相反电荷的黄铜板吸引而发生偏转。

这些含有X精子或Y精子、没有精子或多于一个精子的液滴流经喷口，被收集于3个不同的容器中。这项分拣技术能使性别分离和收集的精子达40%，精子约以100km/h的速度通过分拣仪，处理精子的速率为20000个/s（以总精子数计）。这样，每秒可同时分拣4000个两性别的精子，因而能以每小时 （10-13）×106的速率生产各性别活精子，准确率达 85～95%。

经分离的精子，按授精剂量 （通常少于未经筛选分离的精液）包装，再用于人工授精。从Seidel（1999）的试验来看，这种分离技术分离出的精子人工授精所获得的怀孕率（怀孕率稍低，但无统计上的差异）、出生率及随后的生长发育与对照组获得的相似。

2 分离精子在畜牧上的应用

英国的Cogent公司是世界上第一家利用分离精子技术投入生产的公司。2000年7月，在英国皇家农业博览会上，Cogent公司正式宣布为其下属的牧场提供奶牛分离精子的服务。Cogent拥有10台流动细胞分拣仪，全天24h运转，该公司分离X精子和Y精子的日产量为24亿个。直至2002年，该公司已在其属下的162个农场进行了2000头牛的人工授精。分离精子市场处于供不应求的状况，只能满足其下属的牧场。

除美国和英国外，世界上目前拥有流动细胞分拣仪的国家还有瑞士、日本、澳大利亚、德国、阿根廷等，但这些国家尚处于研究或者中试阶段。

尽管目前最科学有效的分离精子的方法是流动细胞分拣仪分离法，而且分离X精子和Y精子的速度也在不断提高。但是，要大量地应用于牛的人工授精，分离速度还是显得较慢。因此，如何进一步提高分离速度是今后研究的重要课题。分离精子受精后的怀孕率亦需进一步提高。