■ 文远红 黄燕华 王国霞 莫文艳 陈晓英 米海峰 曹俊明

（1.通威股份有限公司水产研究所，四川成都 610041；2.广东省农业科学院动物科学研究所，广东广州 510640；3.广东省动物育种与营养公共实验室，广东广州 510640；4.广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东广州 510640）

鱼粉是水产饲料主要的蛋白源，但鱼粉资源有限、价格高昂，其使用量近年来受到了限制。寻求鱼粉替代源以达到降低饲料成本、提高经济效益成为国内外关注的焦点。蝇蛆粉是常见的昆虫资源，其蛋白质、氨基酸含量高，维生素、矿物质丰富，含有抗菌肽、壳聚糖等免疫活性物质，是一种营养全面的蛋白源。已有研究表明，蝇蛆粉可替代非洲鲶鱼（Clarias gariepinus）、黄鳝（Monopterus albus）、鲤鱼（Cyprinus carpio）、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）饲料中40%～100%的鱼粉，不会对养殖动物生长性能、饲料利用率、血清生理生化指标产生负面影响。消化酶是动物消化腺和消化系统分泌的具有消化水解食物中各营养素的酶类，在动物机体内起着重要的作用。水产动物消化酶活性的研究是水产动物营养生理学和饲料学的主要研究内容，消化酶活性的高低直接影响水产动物对营养物质的吸收利用和生长速度。肠道是水产动物主要的消化吸收部位，肝胰脏是水产动物最主要的消化腺，其组织结构是否正常对动物的消化吸收能力有着重要的影响，也是认识和探讨水产动物消化吸收能力、机体健康状况等生理学的基础。因此，了解消化酶活性的高低和消化器官组织结构的异常对于评价鱼粉替代蛋白源具有重要的意义。

黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）属鲶形目、鲿科、黄颡鱼属，俗称黄骨鱼，属温水性底层鱼类，其含肉率高、肉质细嫩、无肌间刺、味道鲜美、营养丰富，是我国常见淡水经济鱼类，深受人们的喜爱，近年来在我国的养殖规模不断扩大。目前，有关蝇蛆粉替代鱼粉对黄颡鱼抗氧化指标、消化酶活性、肠道和肝胰脏组织结构影响的研究尚未见报道。本文研究了蝇蛆粉替代鱼粉对黄颡鱼抗氧化指标、消化酶活性、前肠和肝胰脏组织结构的影响，以期为蝇蛆粉替代鱼粉在黄颡鱼饲料中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

试验用蝇蛆干购买于河北省玉田县某蝇蛆养殖场，饲养原料主要为麸皮，为鲜蝇蛆在自然条件下阴干所得。在实验室粉碎后过80目筛，-20℃冰箱中保存备用。经分析测定，蝇蛆粉的水分、灰分、粗蛋白质、粗脂肪、总磷和钙含量分别为（%风干基础）：8.2、10.8、53.0、13.5、1.1、1.0，能量为20.9 kJ/g。

以秘鲁红鱼粉、豆粕、玉米蛋白粉为蛋白源，大豆油、鱼油为脂肪源，高筋面粉为糖源配制对照组饲料，用蝇蛆粉等蛋白替代对照组饲料中20%、40%、60%、80%和100%的鱼粉，配制5种试验饲料。6种饲料粗蛋白质约为39.5%，总能约为16.8 kJ/g，其配方及营养成分见表1。饲料原料粉碎后过80目筛，逐级混匀，再加入鱼油、豆油和水，混匀后用SLX-80型双螺旋杆挤压机将其制成直径为2.0 mm的颗粒饲料，50℃烘干，自然冷却装入密封袋，保存于-20℃冰箱中备用。

1.2 试验鱼与饲养管理

试验用黄颡鱼幼鱼购于广东省清远市黄沙渔业基地，购回后在广东省农业科学院动物科学研究所水产研究室的室内循环水养殖系统中驯养2周，每天饱食投喂某商品黄颡鱼0号料2次（08：00、17：00）。循环水系统由24个容量为350 L（直径为80 cm，高70 cm）的圆柱形玻璃纤维缸组成。试验开始时，挑选出体格健壮、体表无伤、平均体质量约为2.02 g的黄颡鱼960尾，随机分为6个处理组，每组4重复，每重复放养幼鱼40尾，分别投喂6种配合饲料，记为G0、G20、G40、G60、G80和G100。每日饱食投饲3次（08：00、14：00和18：00），投饲量为体重的4%～6%，根据生长和摄食情况进行调节。每日记录投饲量、死亡情况、水温。光照为自然光源，全天24 h不间断曝气，水温27.0～30 ℃，氨氮＜0.02 mg/l，亚硝酸＜0.05 mg/l，pH值7.3～8.0。饲养试验为期60 d。

表1 饲料配方及营养成分（干物质）

1.3 样品采集与分析

1.3.1 样品采集

饲养试验结束时，禁食24 h，每个重复取12尾鱼，尾静脉取血于抗凝管（BD公司）中混匀，于4℃4 000 r/min离心10 min，制备血浆样品，-80℃保存，用于血浆相关指标测定。每个重复取6尾鱼，分离出胃、前肠、肝胰脏，用4℃预冷的生理盐水将胃、肠道内容物和肝胰脏血脂冲洗干净，滤纸吸干后装入离心管，于-80℃保存，用于黄颡鱼消化酶活性及肝胰脏相关酶活指标测定。每个重复取4尾鱼，分离出前肠、肝胰脏置于Bouin氏试液中固定，室温保存，用于前肠、肝胰脏组织切片制作。

1.3.2 血浆和肝胰脏丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性测定

血浆和肝胰脏丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性测定采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，具体测定方法见试剂盒说明书。

1.3.3 消化酶活性测定

粗酶液制备：称取一定量新鲜组织（胃、前肠、肝胰脏），滤纸吸干组织表面水分后用10倍生理盐水（1 g组织∶9 ml生理盐水）在冰水浴中匀浆，匀浆液在4℃ 3 000 r/min离心10 min，取上清液为粗酶液。

消化酶活性的测定：①蛋白酶活性测定采用福林-酚试剂法。以1%酪蛋白作为底物，在660 nm波长处比色，测定吸光度值。蛋白酶活性定义为：每毫克组织蛋白在37℃下每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为一个酶活性单位(U)。②淀粉酶活性的测定采用3,5-二硝基水杨酸显色法。以2%可溶性淀粉溶液为底物，在540 nm波长处比色，测定吸光度值。淀粉酶活性定义为：每克组织蛋白在30℃条件下与底物作用30 min，每分钟水解淀粉生成1 mg麦芽糖为一个酶活性单位(U)。③脂肪酶活性的测定采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，具体测定方法见试剂盒说明书。脂肪酶活性定义为：每克组织蛋白在37℃条件下与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为一个酶活性单位(U)。

1.3.4 前肠和肝胰脏组织结构观察

石蜡切片制作：取出用Bouin氏试液固定的组织，用乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片（厚度为6 μm），40 ℃展片，苏木素和伊红（HE）染色，中性树胶封片。

光镜观察：用光镜（Nikon 80i）观察前肠和肝胰脏组织切片，其中肠道切片放大倍数为100倍，肝胰脏切片放大倍数为200倍。

1.4 数据统计与分析

数据用“平均值±标准差（x±SD,n=4）表示”。用SPSS 16.0软件进行数据统计与分析。先检验数据方差齐性，若满足方差齐性，进行单因素方差分析（oneway ANOVA），差异显著再作Tukey多重比较；若不满足方差齐性，用Dunnett's T3检验法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 蝇蛆粉替代鱼粉对黄颡鱼MDA含量和SOD活性的影响（见表2）

表2 蝇蛆粉替代鱼粉对黄颡鱼血浆、肝胰脏MDA含量和SOD活性的影响

由表2可知，G20～G100黄颡鱼血浆MDA含量显著低于G0（P＜0.05），但肝胰脏MDA含量不受蝇蛆粉替代水平的影响（P＞0.05）。与G0相比，G60～G100血浆SOD和G60肝胰脏SOD活性显著升高（P＜0.05）。

2.2 蝇蛆粉替代鱼粉对黄颡鱼胃、前肠和肝胰脏蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性的影响（见表3）

表3 蝇蛆粉替代鱼粉对黄颡鱼胃、前肠和肝胰脏蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性的影响

如表3所示，G0和G40黄颡鱼胃蛋白酶活性显著高于其他各组（P＜0.05）；与G0相比，G20～G100前肠蛋白酶活性显著升高（P＜0.05），G20～G100肝胰脏蛋白酶活性显著降低（P＜0.05）。G20～G100胃脂肪酶、G60～G80前肠脂肪酶、G20肝胰脏脂肪酶活性显著低于G0（P＜0.05），G100前肠脂肪酶、G40～G80肝胰脏脂肪酶活性显著高于G0（P＜0.05）。黄颡鱼胃淀粉酶活性不受蝇蛆粉替代水平的影响（P＞0.05）；与G0相比，G20～G100前肠淀粉酶、G40～G60肝胰脏淀粉酶活性显著升高（P＜0.05）。

2.3 蝇蛆粉替代鱼粉对黄颡鱼前肠、肝胰脏组织结构的影响

蝇蛆粉替代鱼粉对黄颡鱼前肠、肝胰脏组织结构的影响如图1、图2所示。从图1a～f可以看出，黄颡鱼前肠组织结构可分为黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层，黏膜突起形成皱襞（绒毛）。其中图1 a～e前肠黏膜上皮细胞排列整齐，纹状缘发达，杯状细胞较多，固有膜结缔组织正常，前肠组织未发现病理损伤。但图1 f前肠黏膜上皮细胞空泡变性，部分纹状缘脱落，杯状上皮细胞增生、固有膜结缔组织疏松，出现病理损伤症状。从图2 g可以看出黄颡鱼肝胰脏肝小叶结构不明显，肝细胞呈索状排列，未发现病理性损伤现象。观察发现，图2 h～l肝胰脏实质结构受到破坏，肝细胞间充满了脂肪粒，脂肪沉积随蝇蛆粉替代鱼粉比例的增加而逐步加重，形成明显的脂肪肝，图2 l最为明显；其中G60组肝细胞受损破裂，出现出血性坏死灶等症状，其他图中未发现肝细胞坏死现象。

3 讨论

3.1 蝇蛆粉替代鱼粉对黄颡鱼抗氧化能力的影响

图1 蝇蛆粉替代鱼粉对黄颡鱼前肠组织结构的影响

图2 蝇蛆粉替代鱼粉对黄颡鱼肝胰脏组织结构的影响

MDA是脂质发生过氧化作用的产物，是反映机体脂质过氧化程度的重要指标，也可间接反映机体细胞受损伤程度。SOD是机体内有害物质超氧阴离子自由基的天然清除剂，保护细胞膜免受自由基攻击，活性高低可反映机体清除自由基的能力。本试验结果表明，当蝇蛆粉替代鱼粉水平超过20%时，黄颡鱼血浆和肝胰脏MDA含量出现不同程度的降低，G60～G100血浆SOD和G60肝胰脏SOD活性显著升高，这在一定程度上提高了黄颡鱼机体抗氧化能力；这与曹俊明等的研究结果不一致，其研究指出，当家蝇蛆粉替代鱼粉水平超过60%时，将使凡纳滨对虾机体处于氧化应激状态；这可能与凡纳滨对虾与黄颡鱼属不同两种动物有关。Ogunji等报道，蝇蛆粉不会引起尼罗罗非鱼机体生理应激和氧化应激效应。本试验中，蝇蛆粉替代鱼粉提高了黄颡鱼机体抗氧化能力，这可能与蝇蛆粉含有抗菌肽、壳聚糖等免疫活性物质能提高动物机体抗氧化能力有关。张婷等报道，在黄羽肉仔鸡饲料中添加0.5%家蝇幼虫肽，可显著提高仔鸡的抗氧化能力和生长性能。

3.2 蝇蛆粉替代鱼粉对黄颡鱼消化酶活性的影响

本试验结果显示，蝇蛆粉替代鱼粉显著影响黄颡鱼胃、前肠和肝胰脏蛋白酶活性，这与杨帆的研究结果不同。杨帆的研究表明，当蝇蛆粉替代鱼粉比例低于50%时，胃、前肠、后肠和肝胰脏蛋白酶活性与对照组相比差异不显著，当替代比例继续增加时，蛋白酶活性则显著降低。出现这些差异的原因可能与养殖动物、蝇蛆粉来源、饲料蛋白质含量及试验条件等因素有关。据报道，消化酶的分泌量、活性与消化系统和机体整体代谢水平相关。Debnath等报道，野鲮（Labeo rohita）蛋白酶活性随饲料蛋白质含量的增加而显著升高。陈鹏飞等指出，丁鱥（Tinca tinca）肠和肝胰脏蛋白酶活性随饲料中鱼粉比例的增加而显著升高。本试验饲料中蛋氨酸、赖氨酸等必需氨基酸含量随蝇蛆粉替代鱼粉比例上升而下降，其中蛋氨酸含量由0.91 g/100 g降至0.74 g/100 g，赖氨酸由2.82 g/100 g降至1.42 g/100 g。其含量不足可能影响胃、肝胰脏蛋白酶活性。苏时萍等报道，黄粉虫和蚕蛹粉必需氨基酸含量较低、组成不平衡，显著影响黄颡鱼肝胰脏、肠道和胃的蛋白酶活性。迟淑艳等指出，在低鱼粉饲料中添加微胶囊蛋氨酸可提高凡纳滨对虾肝胰腺蛋白酶活性。蝇蛆粉壳聚糖含量较高，一般在11%左右，饲料中壳聚糖含量随蝇蛆粉替代鱼粉水平的增加而逐渐升高，可能影响了黄颡鱼前肠蛋白酶活性。翟少伟等研究指出，在饲料中添加昆虫壳聚糖可显著提高鲫鱼（Carassius auratus）肠道蛋白酶活性。

脂肪酶是一类酯键水解酶，能够水解甘油酯、磷脂等脂类，脂肪在其作用下分解成甘油和脂肪酸。本试验中，各替代组黄颡鱼胃、G60～G80前肠脂肪酶活性显著降低，G40～G80肝胰脏脂肪酶显著升高，这可能与饲料脂肪源、蝇蛆粉多不饱和脂肪酸含量较低有关。已有研究表明，鱼类脂肪酶的分泌量受饲料脂肪含量和脂肪源的影响。郭占林等报道，不同脂肪源显著影响红螯光壳螯虾（Cherax quadricarinatus）幼虾肝胰腺脂肪酶活性，其中花生油组和豆油组脂肪酶活性最高，鱼油组和猪油组脂肪酶活性最低。已有研究结果指出，水产动物对动物油的消化利用率低。本试验中替代组鱼胃、G60～G80前肠脂肪酶活性显著降低可能与蝇蛆粉油脂含量较高（13.45%）、黄颡鱼对其的消化利用率较低有关；G40～G80肝胰脏脂肪酶活性显著升高可能与肝胰脏是脂肪代谢主要器官和肝胰脏是鱼类脂肪酶主要分泌器官有关。

淀粉酶是一类催化水解淀粉、降解碳水化合物的酶类，有利于水产动物对饲料碳水化合物的利用，淀粉酶活性与养殖动物、消化组织、饲料组成等因素有关。饲料碳水化合物（高筋面粉）含量随蝇蛆粉替代鱼粉比例的增加而逐渐降低（见表1），G20～G100组黄颡鱼前肠淀粉酶、G40～G60组肝胰脏淀粉酶活性显著增加。这说明黄颡鱼淀粉酶活性对饲料淀粉含量的适应程度较低，这与刺参（Apostichopus japonicus）、中国对虾（Penaeus chinensis）肠道淀粉酶活性与饲料淀粉含量关系的结果较为一致。韩勃等指出，黑鲷（Hephaestus fuliginosus）肠道淀粉酶活性随饲料碳水化合物含量的增加而逐步增加，但高含量（34%～42%）组间差异不显著，其指出食物中淀粉会刺激肠道分泌淀粉酶，但这种调节作用有限。本试验中，前肠和肝胰脏淀粉酶活性不同程度升高，可能与饲料中蝇蛆粉壳聚糖含量逐渐增加有关。已有研究结果表明，昆虫壳聚糖可显著提高鲫鱼肠道淀粉酶活性和异育银鲫（Carassius auratus gibelio）肝胰脏淀粉酶活性。

3.3 蝇蛆粉替代鱼粉对黄颡鱼前肠和肝胰脏组织结构的影响

肠道是鱼类消化吸收营养物质重要的场所，其由黏膜层、黏膜下层、肌肉层和浆膜层构成，其中黏膜层是消化吸收营养物质的关键部位，肠上皮细胞是吸收营养素的主要细胞。肠道结构完整性对鱼类消化能力有着重要的影响。已有研究结果表明，养殖动物肠道上皮细胞脱落、上皮细胞核上空泡消失、黏膜皱襞固有层变宽、杯状细胞数量增多等肠道正常形态结构受到破坏后，将导致养殖动物对营养物质消化吸收能力下降。本试验中，除100%替代组前肠皱襞上皮细胞出现空泡变性，部分纹状缘脱落等病理损伤外，其他组均未出现病理损伤，这说明蝇蛆粉替代鱼粉水平不超过80%时，不会对黄颡鱼肠道的完整性和形态结构造成明显损伤。关于损伤的原因，可能与G100饲料中精氨酸（2.16 g/100 g）和谷氨酰胺含量不足有关。林燕报道，谷氨酰胺可促进建鲤幼鱼肠道和肠细胞生长，提高皱襞高度。据报道，精氨酸能促进新西兰白兔肠上皮细胞增殖，维持肠黏膜形态结构和功能的完整性。Sukhotnik等在研究精氨酸对大鼠肠道作用时指出，添加适量晶体精氨酸能够提高肠黏膜上皮细胞的增殖速度，促进细胞分化，维护肠黏膜的正常形态结构和功能。

肝胰脏不仅是水生动物最主要的消化腺，也是功能最多的代谢器官，其是机体营养物质代谢和解毒的中心，对外界应激极为敏感。本试验中，黄颡鱼肝胰脏脂肪变性随蝇蛆粉替代水平的增加而加重，其中60%替代组肝细胞出现出血性损伤。随着蝇蛆粉替代鱼粉水平的增加，饲料中n-3系多不饱和脂肪酸含量逐渐降低(16.78%～1.79%)和n-3/n-6比值逐渐降低（0.57～0.08），当蝇蛆粉高水平替代鱼粉时，其含量不足或比值太低可能引起了黄颡鱼肝胰脏组织结构的异常。卢星明指出，黄鳝（Monopterus albus Zuiew）饲料中n-3系多不饱和脂肪酸缺乏或n-3/n-6比例太低容易引起脂肪在肝胰脏中沉积，形成脂肪肝，也容易导致黄鳝肝胰脏组织结构出现损伤。本试验中，G60肝细胞坏死，而G80～G100肝细胞未出现坏死，这是否与蝇蛆粉含有的抗菌肽、壳聚糖、凝聚素等活性物质有关，尚需进一步研究。

4 结论

蝇蛆粉部分替代鱼粉可一定程度上提高黄颡鱼抗氧化能力，对黄颡鱼胃、前肠和肝胰脏消化酶活性均有一定影响（胃蛋白酶除外），对前肠和肝胰脏组织结构产生不同程度的损伤作用。根据黄颡鱼抗氧化能力、消化酶活性和前肠、肝胰脏组织切片，建议蝇蛆粉替代鱼粉水平不宜超过20%。

（参考文献42篇，刊略，需者可函索）