吕婷婷 李万成

·综述·

上皮间质转化在纤维化疾病中分子机制的研究进展

吕婷婷1李万成2

上皮间质转化； 组织纤维化； 分子机制

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是许多胚胎发育过程的一个基本机制，涉及到细胞-细胞间黏附，细胞伸展和固有细胞外基质被新的间质细胞入侵。研究表明，在多种慢性疾病(如纤维化疾病)的发病及肿瘤的发展过程中均有EMT的发生。在此过程中，上皮细胞的正常形态发生改变，变形迁移和运动能力增加，抗凋亡能力增强。目前越来越多的学者开始关注EMT的分子机制及相关信号通路，包括上皮标志蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)，间质标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)，波形蛋白(vimentin)和β-连环蛋白(β-catenin)，以及多种转录因子。其中果蝇粒状头样转录因子(grainy head-like, GRHL)是一种新型转录因子，是哺乳动物所具有的一种似果蝇粒状头样的转录因子，与EMT的发生过程密切相关，直接或间接的参与了组织纤维化的发生过程。

一、EMT的概念

EMT是指上皮细胞失去了它们原本的上皮特点，而获得了一些间质细胞的特性，表现为细胞之间黏附力降低、细胞拉长呈纺锤型，具备运动和迁移的能力，形态接近成纤维细胞。上皮细胞伸出伪足，脱离周围细胞并突破基底膜形成新的间质细胞[1]。EMT是许多胚胎发育过程的一个基本机制，根据功能的不同，可将EMT分为1、2、3三型，其中1型EMT涉及到原始上皮细胞转化成间质细胞，参与原肠胚形成及移植；2型EMT与肺纤维化的发生发展关系密切，参与组织纤维化在炎症环境中形成；3型主要在肿瘤细胞的侵袭和转移中起着重要作用，涉及上皮肿瘤细胞转化成转移瘤细胞，作为肿瘤细胞转移的过度阶段[2]。EMT主要表现为细胞黏附分子(E-cadherin)表达缺失，上皮标志物下调和间质标志物Vimentin和SMA等上调而获得成纤维细胞形态。EMT并非简单地上皮细胞向成纤维细胞的广泛转化，而是上皮细胞可逆地获得间质细胞的特性并增强机制联系的一种级联反应[3]。

二、纤维化疾病中EMT相关的分子机制

在纤维化发生中起最关键作用的是产生胶原的肌成纤维细胞。纤维化组织的肌成纤维细胞的主要来源有三种：组织固有的成纤维细胞增生和激活，EMT和循环中来源于骨髓纤维细胞的迁移[4]。纤维化的病理改变以大量的成纤维细胞聚集、细胞外基质沉积并伴有炎症和组织损伤所致的结构破坏为特征。纤维化早期以组织炎性改变为主，包括多种细胞因子的渗出和大量炎性细胞的浸润，后期成纤维细胞大量增生，胶原沉积，逐渐发展为不可逆的间质纤维化[5]。现阶段已发现许多类型的蛋白与EMT密切相关，主要包括细胞表面蛋白、细胞骨架蛋白、细胞外基质(extracellular matrixc, ECM)和转录因子。

1．细胞表面蛋白: E-cadherin是细胞表面蛋白的一种，它是锚定上皮细胞间黏附连接的主要蛋白，是一种钙依赖性细胞表面蛋白，可以促进上皮细胞间的黏附。在胚胎发育，组织纤维化和癌症过程中E-cadherin的表达减少[6]。核内E-cadherin的减少或丧失会导致细胞间黏附力降低并导致β-catenin的释放，从而转移到核内诱导EMT基因，如TWIST的转录。EMT可以促进细胞从基底膜上转移到细胞外基质中，该过程涉及到整联蛋白表达的变化[6]。整联蛋白是α和β亚基组成的异源二聚体形式的黏附受体。整合素通过形成细胞骨架和细胞外基质之间的跨膜连接从而调节细胞和细胞外基质之间的相互作用，进而对EMT的发生产生影响。

2．细胞骨架蛋白: 促进EMT的细胞骨架蛋白包括α-SMA，Vimentin和β-catenin。表达α-SMA的细胞可以促进胚胎发生阶段的EMT以及正常上皮细胞的伤口愈合[6]。α-SMA的表达受生长因子调控，主要表现为间质蛋白的特性。大量研究表明在EMT过程中α-SMA呈高表达状态。Vimentin作为中间丝可以将间充质细胞与上皮细胞区分开，它通常作为纤维化过程中EMT的标志之一。不稳定的细胞群往往具有间质特性，包括Vimentin与整联蛋白β1表达增加，上皮标志物E-cadherin表达减少。然而，不稳定来源的细胞往往Vimentin表达水平较低。Wnt/β-catenin信号通路在纤维化过程中起着至关重要的作用。E-cadherin主要通过胞质蛋白斑块β-catenin而锚定在细胞骨架上[7]。在发生EMT的细胞中，β-catenin与E-cadherin解体而游离于胞浆中，胞浆中游离的β-catenin转移到核内，促进那些EMT相关基因的转录。核β-catenin与T-细胞因子(T-cell factor，TCF)/淋巴增强结合因子(lymphoid enhancer factor，LEF)形成一种转录共活化剂，可以调控snail1基因的转录。

3．细胞外基质蛋白(ECM): 纤维化疾病中，促进EMT的细胞外基质蛋白包括胶原蛋白、纤维连接蛋白和层黏连蛋白。胶原蛋白是细胞外基质的重要结构成分，胶原蛋白I和II是丝状蛋白，胶原蛋白IV是膜状蛋白，是基底膜的主要成分。在1型和3型EMT中，胶原蛋白I和III表达增加，而在EMT全部的三种亚型中胶原蛋白IV均表达减少[6]。纤维连接蛋白作为一种糖蛋白骨架形成纤维形细胞外基质。在正常细胞中，纤维连接蛋白能够调节与细胞外基质的细胞相互作用，而且在细胞迁移、分化、生长和黏附方面都是很重要的。层黏连蛋白与胶原蛋白类似，是基底膜的一种主要成分，是由一条α链，一条β链，一条γ链组成的糖蛋白。目前知道层黏连蛋白有15种异三聚体。其中层黏连蛋白1(α1β1γ1)与1型和2型EMT关系最为密切。

4．转录因子: 研究表明与纤维化疾病相关的转录因子主要包括snail，TWIST，LEF-1 和GRHL2。在纤维化疾病中，snail，TWIST和LEF-1等转录因子表达增加可促进EMT发生。snail蛋白能够调控EMT表型的各个方面，包括促进间质标志物的过表达，抑制上皮标志物的表达。因此，snail在纤维化疾病中起着至关重要的作用。TWIST在3种类型的EMT中均可被激活，在纤维化疾病中可被上调，抑制TWIST可逆转EMT和纤维化表型的形成。LEF-1与TCF形成共转录激活物，从而调节WNT信号通路。在EMT过程中，β-catenin/LEF-1复合体主要集中分布在胞核中，从而调节snail基因以及与EMT相关的其他标志物的表达。

然而，与上述转录因子不同的是，下调GRHL2能够间接的促进EMT发生。GRHL是哺乳动物所具有的一种似果蝇粒状头样的转录因子，主要表达在外胚层来源的组织中，调控几个重要的发育过程，包括角质层的形成，气管伸长和昆虫的背向闭合。目前发现GRHL家族包括GRHL1/2/3三种亚型，它们表现出序列和生物化学方面的相似性[8-9]。其中GRHL2在调控人类气道上皮的多种生理功能方面起着关键作用，包括细胞形态发生、黏附和动力以及建立和维持气道上皮的屏障功能，并识别出许多重要的靶基因[10-11]。研究发现，在射线诱导损伤的大鼠肺纤维化模型中，自发性肺炎和肺纤维化往往伴有白介素(interleukin)表达增加，下调GRHL2能够通过增加EMT的标志转录因子ZEB1的表达，从而促进EMT发生[12]。

三、EMT与纤维化疾病

1． EMT与肝纤维化： 实验研究已表明，肝内细胞，如星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)、胆管细胞等可通过 EMT 转化为基质产生型细胞而参与肝纤维化过程。肝损伤是通过组织纤维化(疤痕形成)和再生重构过程来修复的，当肝脏受到损伤时，创伤周围的胶质细胞会依次经历EMT、上皮层的重新形成或MET过程，而创伤愈合后这些活动便会中止，该过程的核心阶段是组织炎症反应和纤维化形成疤痕。由于肝脏再生能力非常强大，肝纤维化与其他器官纤维化相比过程更加复杂，现阶段认为在肝损伤修复和纤维化发生过程中EMT起着重要作用,这一过程会随着组织中相关细胞因子和生长因子水平的变化而逆转或减弱[13]。Kaimori等[14-15]在对四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的模型进行实验时发现，在其原代肝细胞上，其间质细胞标志如I型胶原蛋白、Vimentin表达上调，同样肝细胞开始表达促进EMT的转录因子snail。研究表明，在体内外肝细胞均能被诱导发生EMT。转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)刺激后的小鼠原代肝细胞可检测到E-cadherin表达降低，Vimentin和1型胶原蛋白表达增高[16-17]。Omenetti等[18]报道，上皮及间叶细胞标志物可以从胆管纤维化大鼠模型中分离出的原代胆管细胞中检测到，表明EMT参与其中。在胆管结扎的小鼠和在原发性胆汁性肝硬化胆道闭锁等疾病中，应用免疫组化的方法可发现胆管细胞表达多种上皮间质标志物，推测可能发生过EMT[19-20]。研究表明，来源于酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎患者的胆管上皮细胞也同时表达上皮及间叶标志如Vimentin、E-cadherin、成纤维细胞特异性蛋白1(Fibroblast specific protein, FSP-1)等[21]。表明在多种慢性肝损害疾病中，胆管细胞也能发生EMT转变为成纤维细胞。越来越多的组织、细胞及分子水平的研究表明，肝脏发生 EMT 时，首先是损伤修复反应的慢性激活，随着氧化应激和相关活性中间体的形成，最后才发展为急剧的 EMT 过程[22-23]。因此，抑制细胞 EMT 过程，减少可产生细胞外基质的肌成纤维母细胞等致纤维化细胞的生成，能减缓甚至逆转肝纤维化，提示EMT 有可能成为有效且副作用更少的肝纤维化治疗靶点。

2．EMT与肺纤维化: 特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)主要表现为弥漫性肺泡炎、肺泡单位结构紊乱和肺间质纤维化。其病理改变以大量的成纤维细胞聚集、细胞外基质沉积并伴有炎症和组织损伤所致的结构破坏为特征，是一种慢性间质性肺病。早期病理改变为肺泡炎，此后纤维化逐渐加重，肺功能呈进行性减退，病因不明，它属慢性进行性发展的致死性疾病，预后差。目前公认IPF的一个主要病因就是反复的肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells, AECs)损伤[3]，早期的损伤可以导致AECs异常激活，形成一种纤维化前期环境，促使产胶原蛋白的成纤维细胞和肌成纤维细胞大量聚集。

研究发现,大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞株 (RT L2 6T N)在接受 TGF2 β1处理后间质细胞的标志物如纤维连接蛋白，α-SMA和Vimentin表达增加，而 E-cadherin和细胞角蛋白-19(Cytokeratin-19)表达却减少，并引起细胞伸长变形为纤维样细胞[24]。Hashimoto等[25]发现博来霉素诱发的肺纤维化小鼠出现肺内皮细胞转化为大量活化的成纤维细胞。TGF-β1是迄今发现的最强的细胞外基质沉积促进剂，TGF-β1 的生物学作用是通过其信号转导途径来完成的，细胞内信号转导就包括胞质内的 Smad 蛋白家族的参与[26]。为了进一步探讨EMT是否在大鼠肺纤维化中有作用，易建华[27]对百草枯中毒大鼠肺纤维化中的EMT过程进行了研究，表明EMT是肺泡上皮细胞转变为间质细胞的重要因素。TGF-β1是百草枯中毒致肺纤维化发生发展过程中重要的细胞因子，其持续高表达可能通过Smad2依赖的TGF-β1/Smads信号转导途径和非Smad依赖的Wnt/β-catenin信号转导途径诱导肺上皮细胞发生EMT。

3. EMT与肾纤维化: 肾纤维化是所有慢性进展性肾病的终末阶段，进行性肾功能减退及终末期肾衰往往与肾小管间质纤维化关系密切。纤维化过程主要表现为成纤维细胞增生，大量细胞外基质产生，最终可导致肾小球硬化及纤维化。有研究称，肾小球在受损的4周左右可检测到上皮细胞中有间质标志物的表达，表明在肾脏损伤修复过程中有EMT存在。此外，在糖尿病肾病，狼疮性肾炎，新月体肾小球肾炎以及IgA肾病等慢性进行性肾病中均可发现肾小管间质标志物的表达，如α-SMA和波纹蛋白。Lv等[28]研究表明在患有糖尿病的情况下，p38 MAPK信号通路在肾小球和肾小球膜部活性增高。比较高浓度和低浓度糖尿病大鼠模型发现，高浓度糖尿病大鼠模型的肾小球上皮中TGF-β1表达增加，同时p38 MAPK信号活性增高。有趣的是，加有TGF-β1的低浓度模型或高浓度模型均可检测到E-cadherin和CK表达却明显减少，Vimentin和α-SMA表达明显增加。

由于肾纤维化表现出β-catenin信号通路的异常激活，该通路可能作为抗纤维化治疗的潜在靶点。Hao等[29]研究表明，离体培养时肾小管上皮细胞(HKC-8) 中β-catenin稳定的异位表达可抑制E-cadherin的表达，并诱导Snail1,纤维连接蛋白以及纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibito-1, PAI-1)的表达。因此骨形成蛋白7(bone morphogenetic protein-7, BMP-7)作为TGF-β的竞争抑制分子，能作用于肾间质纤维细胞(NRK-49F),使Snail 1的表达降低，从而减轻TGF-β1诱导的肾间质纤维化。

4．EMT与其他器官纤维化: 克罗恩病(Crohn′s disease, CD)的晚期症状可表现为肠道狭窄、梗阻，其主要原因就是慢性炎症及肠壁损伤后修复引起的大量细胞外基质沉积导致肠壁纤维化。有报道称，在炎症、缺氧等情况下，肠上皮会发生损伤，形态及功能会发生变化，上皮标志物表达减少，同时间质标志物如Vimentin，α-SMA的表达会大量增加[30]。Flier等[31]通过克罗恩病小鼠模型证明了肠道炎症损伤后导致的肠纤维化是由于EMT引起的，该研究同样用BMP-7抑制TGF-β1，却发现可使小鼠结肠上皮细胞纤维化程度减轻，间质标志物表达减少。

研究认为，心肌损伤后引起的心肌纤维化是由于心肌固有成纤维细胞的增生引起的，而EMT是导致心肌纤维化的主要机制之一。Liu等[32]利用心肌梗死小鼠模型证明了在发生心梗后的区域中，心脏外膜及内膜上皮细胞均能检测到转录因子Snail表达，而该因子是促进EMT发生的关键因子。

四、展望

组织纤维化是许多慢性病的终末阶段，可导致器官功能减退及衰竭，目前治疗上仍是人类所面临的一大难题，因此纤维化的分子基础及发病机制的探讨是研究治疗方法的关键着手点。EMT不仅与胚胎形成发育关系密切，同时在纤维化疾病的发生发展中同样发挥着重要作用。弄清EMT发生的分子机制及其与各种纤维化疾病之间的关系，将为纤维化疾病的临床治疗提供新的靶点和策略，并为针对分子和机制角度的新药开发提供理论依据。

1 LaGamba D, Nawshad A, Hay ED. Microarray analysis of gene expression during epithelial-mesenchymal transformation[J]. Dev Dyn, 2005, 234(1): 132-142.

2 Scanlon CS, Van Tubergen EA, Inglehart RC, et al. Biomarkers of epithelial-mesenchymal transition in squamous cell carcinoma[J]. J Dent Res, 2013, 92(2): 114-121.

3 Chapman HA. Epithelial-mesenchymal interactions in pulmonary fibrosis [J]. Annu Rev Physiol, 2011, 73: 413-435.

4 Piera-Velazquez S, Li Z, Jimenez SA. Role of endothelial- mesenchymal transition (EndoMT) in the pathogenesis of fibrotic disorders [J]. Am J Pathol, 2011, 179(3): 1074-1080.

5 Zavadil J, Bottinger EP. TGF-beta and epithelial tomesenchymal transitions [J]. Oncogene, 2005, 24(37): 5764-5774.

6 Zeisberg M, Neilson EG. Biomarkers for epithelial-mesenchymal transitions [J]. J Clin Invest, 2009, 119(6): 1429-1437.

7 Wheelock MJ, Johnson KR. Cadherins as modulators of cellular phenotype [J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 2003, 19: 207-235.

8 Chen W, Dong Q, Shin KH, et al. Grainyhead-like 2 enhances the human telomerase reverse transcriptase gene expression by inhibiting DNA methylation at the 5′-CpG island in normal human keratinocytes[J]. J Biol Chem, 2010, 285(52): 40852-40863.

9 Wilanowski T, Tuckfield A, Cerruti L, et al. A highly conserved novel family of mammalian developmental transcription factors related to Drosophila grainyhead[J]. Mech Dev, 2002, 114(1-2): 37-50.

10 Ting SB, Wilanowski T, Cerruti L, et al. The identification and characterization of human Sister-of-Mammalian Grainyhead (SOM) expands the grainyhead-like family of developmental transcription factors[J]. Biochem J, 2003, 370(Pt 3): 953-962.

11 Varma S, Cao Y, Tagne JB, et al. The transcription factors Grainyhead- like 2 and NK2-homeobox1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation[J]. J Biol Chem, 2012, 287(44): 37282-37295.

12 Varma S, Mahavadi P, Sasikumar S, et al. Grainyhead-like 2 (GRHL2) distribution reveals novel pathophysiological differences between human idiopathic pulmonary fibrosis and mouse models of pulmonary fibrosis[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2014, 306(5): L405-419.

13 Xue ZF, Wu XM, Liu M. Hepatic regeneration and the epithelial to mesenchymal transition[J]. World J G astroenterol, 2013, 19(9): 1380-1386.

14 Kaimori A, Potter J, Kaimori JY, et al. Trans-forming growth factor l induces an epithelial-to-mesenchymal transition state in mouse hepatocytes in vitro[J]. J Biol Chem, 2007, 282(30): 22089-22101.

15 Rowe RG, Lin Y, Shimizu-Hirota R, et al. Hepatocyte-derived snail1 propagates liver fibrosis pro- gression[J]. Mol Cell Biol, 2011, 31(12): 2392-2403.

16 Kaimori A, Potter J, Kaimori JY, et al. Transforming growth factor-beta1 induces an epithelial-to-mesenchymal transition state in mouse hepatocytes in vitro[J]. J Biol Chem, 2007, 282(30): 22089-22101.

17 Nitta T, Kim JS, Mohuczy D, et al. Murine cirrhosis induces hepatocyte epithelial mesenchymal transition and alterations in survival signaling pathways[J]. Hepatology, 2008, 48(3): 909-919.

18 Omenetti A, Yang L, Li YX, et al. Hedgehog-mediated mesenchymal- epithelial interactions modulate hepatic response to bile duct ligation[J]. Lab Invest, 2007, 87(5): 499-514.

19 Xia JL, Dai C, Michalopoulos GK, et al. Hepatocyte growth factor attenuates liver fibrosis induced by bile duct ligation[J]. Am J Pathol, 2006, 168(5): 1500-1512.

20 Omenetti A, Porrello A, Jung Y, et al. Hedgehog signaling regulates epithelial-mesenchymal transition during biliary fibrosis in rodents and humans[J]. J Clin Invest, 2008, 118(10):3331-3342.

21 Rygiel KA, Robertson H, Marshall HL, et al. Epithelial mesenchymal transition contributes to portal tract fibrogenesis during human chronic liver disease[J]. Lab Invest, 2008, 88(2): 112-123.

22 Parola M, Pinzani M. Hepatic wound repair [J]. Fibrogenesis Tissue Repair, 2009, 2(1): 4.

23 Li P, Zhang HJ, Zheng LT. The theory of homogeny of liver and kidney in the treatment of kidney and liver fibrosis[J]. Chin J Integr Med, 2012, 18(4): 250-252.

24 Xu GP, Li QQ, Cao XX, et al . The effect of TGF-β1 and Smad7 gene transfer on the phenotypic changes of rat alveolar epithelial cells[J]. Cell Mol Biol Lett, 2007, 12(3): 457-472.

25 Hashimoto N, Phan SH, Imaizumi K, et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2010, 43(2): 161-172.

26 吕路艳, 李 青, 宋精玲, 等. 肺心清胶囊对大鼠肺纤维化及其细胞因子TGF- 1 Smad2/3作用的实验研究[J]. 临床肺科杂志, 2012, 17(4)：585-587.

27 易建华. 上皮-间充质转变 (EMT)在百草枯中毒大鼠肺纤维化中的作用及机制探讨[D]. 杭州：浙江大学, 2012: 24.

28 Lv ZM, Wang Q, Wan Q, et al. The role of the p38 MAPK signaling pathway in high glucose-induced epithelial-mesenchymal transition of cultured human renal tubular epithelial cells[J]. PLoS One, 2011, 6(7): e22806.

29 Hao S, He W, Li Y, et al. Targeted inhibition of β-catenin/CBP signaling ameliorates renal interstitial fibrosis[J]. J Am Soc Nephrol, 2011, 22(9): 1642-1653.

30 Lee JM, Dedhar S, Kalluri R, et al. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease [J]. J Cell Biol, 2006, 172(7): 973-981.

31 Flier SN, Tanjore H, Kokkotou EG, et al. Identification of epithelial to mesenchymal transition as a novel source of fi-broblasts in intestinal fibrosis[J]. J Biol Chem, 2010, 285(26): 20202-20212.

32 Liu Y, Du J, Zhang J, et al. Snail1 is involved in de novo cardiac fibrosis after myocardial infarction in mice[J]. Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai), 2012, 44(11)：902-910.

(本文编辑：张大春)

吕婷婷，李万成. 上皮间质转化在纤维化疾病中分子机制的最新研究进展[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2015， 8(1)： 95-98.

·医学动态·

DNA聚合酶θ抑制同源重组，促进肿瘤发生

近日，来自美国纽约大学医学院Agnel Sfeir研究小组发现非同源末端连接过程能够利用聚合酶θ促进肿瘤细胞中的端粒发生染色体末端融合。这项研究对治疗携带同源重组修复突变基因的肿瘤具有重要意义。

研究人员指出，细胞的非同源末端连接(NHEJ)机制能够促进部分基因组重排，但同时也可能导致细胞性状发生转化。这种容错修复途径会在端粒发生脱保护，有害染色体末端融合的情况下被触发。通过下一代测序技术，研究人员发现通过NHEJ修复途径会产生非TTAGGG核苷酸插入到功能紊乱的端粒融合断点位置。通过对负责核苷酸随机插入的聚合酶活性进行研究，研究人员发现聚合酶θ是NHEJ途径中一个非常重要的因子。抑制编码聚合酶θ的基因polq会抑制NHEJ在功能紊乱的端粒处的修复过程，并且阻断非端粒位点的染色体易位。除此之外，在缺失polq的小鼠中，同源重组修复率增加。最后，研究人员通过实验证实删除polθ能够降低BRCA基因缺失的肿瘤细胞的存活。

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.01.026

四川省科技厅基金资助项目(2014JY0176)

610500 成都医学院1610500 成都医学院 第一附属医院呼吸内科2

李万成，Email：316608439@qq.com

R563

A

2014-06-23)