孙丽平， 丁利忠， 王雪姣， 陈思

益气固本胶囊对哮喘小鼠组织病理改变及转化生长因子β1、P-Smad3水平的作用

孙丽平， 丁利忠， 王雪姣， 陈思

目的 观察不同剂量益气固本胶囊对哮喘小鼠病理及气道重塑中TGF-β1/Smad信号通路的影响。方法 将60只雄性SPF级BALB/c小鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松干预组、童康片组、益气固本胶囊高剂量组和益气固本胶囊低剂量组，每组10只。除正常组外，其余各组均以卵清白蛋白致敏和激发复制哮喘模型，于第21天起，在每次激发前1 h分别给予模型组和用药各组以纯净水及药物灌胃，正常组不给予任何处置。应用HE染色观察各组小鼠气道及肺组织的病理学改变，免疫组织化学法检测肺组织TGF-β1和P-Smad3蛋白的表达。结果 小鼠气道病理切片观察模型组的气管、肺组织病理改变程度高于正常组、地塞米松干预组、童康片组、益气固本胶囊高剂量组、益气固本胶囊低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)；地塞米松干预组与益气固本胶囊高剂量组、益气固本胶囊低剂量组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；与正常组相比，TGF-β1蛋白在模型组、地塞米松干预组、童康片组、益气固本胶囊高剂量组、益气固本胶囊低剂量组表达水平增强，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，地塞米松干预组、童康片组、益气固本胶囊高剂量组、益气固本胶囊低剂量组TGF-β1蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)；地塞米松干预组与益气固本胶囊高剂量组、益气固本胶囊低剂量组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)；益气固本胶囊高剂量组与益气固本胶囊低剂量组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；与正常组相比，P-Smad3蛋白在模型组、地塞米松干预组、童康片组、益气固本胶囊高剂量组、益气固本胶囊低剂量组表达水平增强，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，地塞米松干预组、童康片组、益气固本胶囊高剂量组、益气固本胶囊低剂量组P-Smad3蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.01)；地塞米松干预组P-Smad3蛋白表达比童康片组、益气固本胶囊高剂量组、益气固本胶囊低剂量组更低，差异有统计学意义(P<0.01)；童康片组与益气固本胶囊高剂量组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；益气固本胶囊高剂量组与益气固本胶囊低剂量组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 益气固本胶囊可抑制哮喘小鼠体内TGF-β1和P-Smad3的过度表达，从而阻断TGF-β1胞内信号转导，可在一定程度上减轻哮喘小鼠气道炎症和抑制气道重塑的发生发展。

哮喘； 益气固本胶囊/治疗应用； 气道重塑； 转化生长因子β1； Smad3； 小鼠

气道重塑作为支气管哮喘的重要病理变化之一，与哮喘的严重程度及症状存在密切相关。目前发现转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smad信号通路是哮喘气道重塑形成的重要信号转导机制之一，包括配体、受体或受体后信号转导等多个环节[1]，TGF-β1是目前发现的活性最强的促气道纤维化因子，也是研究哮喘气道重塑的重点[2]，其通过TGF-β1/Smad信号通路导致细胞外基质沉积和基底膜层成纤维细胞增生[3-4]，Smads蛋白是TGF-β1信号转导系统的重要成员，在TGF-β1的信号转导过程中，Smad3蛋白起正性调节作用，增强其生物学表达活性，促进气道重塑的发生发展[5]。益气固本胶囊系根据国家名老中医王烈教授验方制成，用于哮喘病缓解期的治疗，具有益气养阴，补肺脾肾的功效，本方临床运用多年，可有效降低哮喘复发率[6]。但其在气道重塑中是否发挥作用尚未可知。本课题选择P-Smad3作为TGF-β1/Smad通路的下游信号调节蛋白，观察不同剂量益气固本胶囊对哮喘小鼠气道重塑中TGF-β1/Smad信号通路的影响，研究其抑制气道重塑作用，以期进一步阐明其作用机制，为临床应用推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雄性BALB/c小鼠60只，体质量19～21 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供(许可证号：SCXK(辽)2010-0001)。

1.2 仪器与药物 CC2170A型超声雾化器(成都维信电子科大新技术有限公司)；TGF-β1成套免疫组织化学试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；P-Smad3抗体(bs-3425R北京博奥森生物技术有限公司)；卵清白蛋白(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；测平均吸光度值为日本尼康NIS-ELEMENTs BR软件；地塞米松(阿特维斯佛山制药有限公司)，童康片(长春中医药大学附属医院)，益气固本胶囊(长春中医药大学附属医院)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠哮喘模型制作与分组 采用随机数字表法将60只雄性SPF级BALB/c小鼠分为正常组、模型组、地塞米松干预组、童康片组、益气固本胶囊高剂量组和益气固本胶囊低剂量组，每组10只。除正常组外，其余组均于第0、7、14天经腹腔注射含卵清白蛋白20 mg、氢氧化铝200 mg的致敏液，按20 mL/kg进行注射，正常组不给予任何处置。第21天起，除正常组外，其余组以5%卵清白蛋白溶液雾化激发，每次30 min，连续10 d，在每次激发前1 h按20 mL/kg分别给予各组以纯净水及药物灌胃，正常组不给予任何处置。根据临床用量，折算成小鼠的等效剂量如下：地塞米松0.412 5 mg/kg；童康片0.42 g/kg；益气固本胶囊高剂量组2.2 g/kg；益气固本胶囊低剂量组1.1 g/kg。

1.3.2 肺组织病理学观察 实验小鼠于末次激发后1～2 h处死，取0.5 cm气管及部分肺组织，经10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，用于组织病理学观察。观察方法:观察每张切片至少5个具有代表性的高倍视野，根据每个视野中气道上皮细胞的脱落及肺组织炎症细胞所占的比例得出其炎症程度，每个视野中气道脱落的上皮细胞及肺组织炎症细胞所占比例之和<15%属正常范围，为0级；16%～30%属轻度，为1级；31%～60%属中度，为2级；>60%属重度，为3级。

1.3.3 免疫组织化学法检测 检测步骤按说明书进行，依次为切片常规脱腊至水，3%过氧化氢阻断10 min，煮沸20 min抗原修复，兔血清封闭20 min，一抗37 ℃孵育1 h，生物素化二抗孵育20 min，滴加链霉素化亲和素试剂20 min，DAB镜下控制染色，HE复染2 min，酒精脱水二甲苯透明，中性胶封固，显微镜下观察气道及肺组织着色情况。阳性结果呈棕黄色，每张切片随机选择4个高倍镜下支气管视野(×400)，应用NIS-ELEMENTs BR分析软件测定阳性部位的平均吸光度(mean optical density，MOD)，MOD值越大，蛋白表达水平越高，10个MOD值的均值即为该片的MOD值。

2 结果

2.1 气管、肺组织病理学切片观察及分级结果 见表1。高倍镜下观察气道、肺组织病理改变情况可见：正常组支气管结构未见异常改变，支气管黏膜上皮完整，肺泡结构未见异常改变，炎症浸润<15%，为正常范围，属0级；模型组肺组织内可见大量炎性细胞浸润，黏膜下可见水肿，气道上皮细胞可见脱落，支气管壁明显增厚；用药各组病理改变较模型组减轻(图1，见封三)。

表1结果表明，6组小鼠肺组织病理改变程度分级比较差异有统计学意义(P<0.05)，进一步进行两两比较，正常组与模型组、用药各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；模型组与用药各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；地塞米松干预组与童康片组、益气固本胶囊高剂量组、益气固本胶囊低剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)；童康片组与益气固本胶囊高、低剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)；益气固本胶囊高、低剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 肺组织TGF-β1蛋白和P-Smad3蛋白的表达 见表2。TGF-β1蛋白表达于胞浆(图2，见封三)，P-Smad3蛋白表达于胞浆和胞核(图3，见封三),呈棕黄色表达。

表2结果表明，6组小鼠肺组织TGF-β1蛋白和P-Smad3蛋白表达比较差异有统计学意义(P<0.01)，进一步进行两两比较，与正常组相比，TGF-β1蛋白和P-Smad3蛋白在模型组和用药各组表达增强，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，用药各组TGF-β1蛋白和P-Smad3蛋白表达降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；地塞米松干预组TGF-β1蛋白与益气固本胶囊高、低剂量组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)。地塞米松干预组TGF-β1蛋白表达低于童康片组，(P<0.01)。地塞米松干预组P-Smad3蛋白比童康片组、益气固本胶囊高剂量组、益气固本胶囊低剂量组表达更低，差异有统计学意义(P<0.01)； 童康片组P-Smad3蛋白与益气固本胶囊高、低剂量组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；益气固本胶囊高、低剂量组TGF-β1蛋白和P-Smad3蛋白表达相比，差异均无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

哮喘气道重塑的主要结构变化包括：炎症细胞浸润、黏液腺下腺体增生、杯状细胞增生、基底膜增厚、细胞外基质蛋白沉积、气道平滑肌增厚等，其中平滑肌细胞增生肥大占有重要地位[7]。TGF-β1可刺激平滑肌细胞数目增多，体积增大，促进成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，加速气道重塑的形成[8-10]。Smads蛋白是TGF-β信号转导通路的重要成员，为TGF-β受体复合物的下游信号调节蛋白，TGF-β1与其Ⅰ、Ⅱ受体结合后被激活，与受体调节型蛋白结合(Smad2、3)，并使之活化，继而与Smad4形成杂聚体，转移入核后，参与调控细胞的增殖、转化、合成、分泌和凋亡，而Smad7可阻滞TGF-β1受体Ⅰ[11]。由此可见，在TGF-β1/Smad信号转导系统中，Smad3发挥正性调节作用，可促进TGF-β1的表达，从而促进气道重塑的发展，而Smad7发挥负性调节作用，抑制TGF-β1的表达，从而抑制气道重塑的发展。Caraci等[12]发现TGF-β1可诱导肺成纤维细胞中α平滑肌肌动蛋白(SMA)表达和胶原蛋白的产生，促进其转化为肌成纤维细胞。Shin等[13]发现经卵清白蛋白激发哮喘的小鼠，与正常对照组相比，TGF-β1、P-Smad3蛋白表达显著增强，孟鲁司特可降低TGF-β1、Smad3蛋白的表达水平，减轻哮喘气道炎症与肺纤维化。

西医学对哮喘的治疗方案有吸入糖皮质激素、β2-受体激动剂，口服白三烯受体拮抗剂氨茶碱，抗IgE单克隆抗体治疗，抗生素治疗，变应原特异性免疫疗法，抗肿瘤坏死因子α治疗等，地塞米松是治疗哮喘的抗炎药物。

本研究所用益气固本胶囊系根据王烈教授验方制成，其主要成分为黄芪、玉竹、五味子、补骨脂、女贞子、太子参等，用于哮喘病缓解期的治疗，具有益气养阴，补肺脾肾的功效。黄芪味甘，性微温，归肺、脾、肾经，入肺充肺气，入脾健脾胃以绝生痰之源，入肾补肾脏之元气不足；补骨脂、女贞子为臣药，补肾中之阴阳；牡蛎、五味子收敛肺气、固表止汗为佐药；达到补肺助其宣降以清痰窠，健脾助其运化以绝痰源，补肾壮其元气以充肺根，从而除伏痰，铲夙根，临床运用多年，有降低哮喘复发率的作用。前期研究已表明，该药可以通过调节肺气虚、脾气虚和肾阳虚小鼠免疫功能而发挥治疗哮喘作用[14-17]。

本研究旨在研究益气固本胶囊是否有可能通过抑制气道重塑而发挥治疗哮喘的作用。本实验观察了不同剂量益气固本胶囊对哮喘小鼠气道重塑中TGF-β1/Smad信号通路的调控，为其临床应用推广提供理论依据。

对照药童康片为临床常用调节免疫力的中成药，其成分为黄芪、白术、防风、山药、牡蛎、陈皮，具有补肺固表，健脾益胃，扶助人体正气的功效，临床常作为哮喘患儿的辅助治疗药物。

分析本研究的气管、肺组织病理学切片：与模型组相比，用药各组气道上皮脱落、炎症细胞浸润等程度较轻，气道炎症改善。且地塞米松干预组与益气固本胶囊高剂量组、益气固本胶囊低剂量组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，益气固本胶囊高剂量组与益气固本胶囊低剂量组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，表明益气固本胶囊改善气道炎症的效果与地塞米松相似，且与剂量无明显关系。

分析本研究的免疫组织化学结果：与正常组相比，TGF-β1蛋白在模型组和用药各组表达显著增强；与模型组相比，用药各组TGF-β1蛋白表达降低；地塞米松干预组与益气固本胶囊高、低剂量组TGF-β1蛋白表达相当；益气固本胶囊高、低剂量组TGF-β1蛋白表达相当；表明益气固本胶囊抑制TGF-β1蛋白过度表达的效果与地塞米松相似，且与剂量无明显关系。与正常组相比，P-Smad3蛋白在模型组和用药各量组表达水平增强；与模型组相比，用药各组P-Smad3蛋白表达降低；地塞米松干预组比童康片组、益气固本胶囊高、低剂量组P-Smad3蛋白表达更低；童康片组与益气固本胶囊高剂量组P-Smad3蛋白表达相当；益气固本胶囊高、低剂量组P-Smad3蛋白表达相当，表明益气固本胶囊有抑制P-Smad3蛋白过度表达的作用，但效果不如地塞米松明显，且与剂量无明显关系。

以上结果显示，益气固本胶囊可能是通过下调肺组织TGF-β1、P-Smad3的蛋白表达，影响TGF-β1/Smad信号通路，从而减轻气道炎症，延缓气道重塑，进一步研究可为其治疗哮喘提供实验依据。

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(本文编辑：刘颖)

Effects of Yiqi Guben capsules on pathological changes and the levels of transforming growth factor beta 1 and P-Smad3 in asthmatic mice

SUNLiping,DINGLizhong，WANGXuejiao,CHENSi.

PediatricDepartmentinAffiliatedHospitalofChangchunUniversityofTraditionalChineseMedicine，130021Changchun,China.

Objective To observe the effects of different doses of Yiqi Guben capsules on pathology and TGF-β1/Smad signaling pathway in airway remodeling of asthmatic mice.Method The 60 male SPF level BALB/c mice were randomly divided into normal group, model group, dexamethasone intervention(DSMS) group, Tongkang(TKP) group, Yiqi Guben capsules high dose(YQGBH) group and Yiqi Guben capsules low dose(YQGBL) group, with 10 mice in each group. Apart from the normal group, the other groups were sensitized and stimulated by ovalbumin to copy asthma model. On and from the 21stday, each group was given gavage with pure water and medicines 1 h prior to each excitation except the normal group.Observe pathological changes of airway and lung tissues in each group with HE staining, and detect expression of TGF-β1and P-Smad3 protein in lung tissues with immunohistochemistry.Result The trachea and lung tissue pathological change degree in model group was statistically higher than that of normal group, model group, DSMS group, TKP group, YQGBH group and YQGBL group according to airway pathological examination(P<0.05)；comparing DSMS group with YQGBH group and YQGBL group，the difference was not statistically significant(P>0.05).Compared with normal group，TGF-β1protein expression levels in model group, DSMS group, TKP group, YQGBH group and YQGBL group statistically increased(P<0.01)； compared with model group, TGF-β1protein expression levels statistically decreased in DSMS group, TKP group, YQGBH group and YQGBL group(P<0.01)； comparing DSMS group with YQGBH group and YQGBL group，there was no statistical significance(P>0.05)；comparing YQGBH group with YQGBL group，the difference was not statistically significant(P>0.05)；compared with normal group, the expression levels of P-Smad3 protein increased in DSMS group, TKP group, YQGBH group and YQGBL group(P<0.01)；compared with model group, the P-Smad3 protein expression levels decreased in DSMS group, TKP group, YQGBH group and YQGBL group with statiscal significance(P<0.01)；the P-Smad3 protein expression level of DSMS group was even lower than TKP group, YQGBH group and YQGBL group(P<0.01) and the difference was of statistical significance；comaring TKP group with YQGBH group, the difference was not statistically significant(P>0.05)；comparing YQGBH group with YQGBL group, there was no statistically significant difference(P>0.05). Conclusion Yiqi Guben capsules can block TGF-β1intracellular signal transduction by inhibiting excessive expression of TGF-β1and P-Smad3 in asthma mice, which to a certain extent, reduces asthma airway inflammation in mice and inhibits the occurrence of airway remodeling.

asthma; Yiqi Guben capsules/therapeutic use; airway remodeling; TGF-β1; Smad3; mouse

国家自然科学基金资助项目(81473729)；2012年度吉林省卫生厅科技项目(2012Z125)；吉林省科技厅自然科学基金项目(20150101209JC)

130021 长春，长春中医药大学附属医院儿科(孙丽平，丁利忠，陈思)；130117 长春，长春中医药大学研究生学院(王雪姣)

孙丽平(1970-)，女，医学博士，主任医师，博士研究生导师。研究方向:中医药防治小儿肺系疾病的临床与基础研究，E-mail：slpwzt7063@163.com。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.04.006

R-33

A

1674-3865(2015)04-0311-05

2015-04-20)