车艳楠，曹丽萍，李曙光

(1. 广东省深圳市中医院，广东 深圳 518033; 2. 广东省深圳市宝安区中医院，广东 深圳 518133)

加味双柏软膏是深圳市中医院的院内制剂，主要由黄柏、侧柏叶、大黄、乳香、没药、泽兰、薄荷共7 味中药组方，具有活血化瘀、消肿止痛功效，用于跌打骨折、扭挫伤、筋肉肿痛。笔者对加味双柏软膏的制备工艺进行了研究，制备加味双柏软膏，并对其质量控制方法进行了研究。现报道如下。

1 仪器与试药

LC-20AT 型高效液相色谱仪(日本岛津公司);Sartorius BP 211D 型电子天平(十万分之一，德国Sartorius 公司);MQ 密理博超纯水机，CQ-250-DST 型超声波清洗仪(250 W/40 kHz，上海生析超声仪器有限公司)。黄柏等药材经深圳市中医院药检室检验，均符合药典标准;水为超纯水;甲醇为色谱纯(德国Merck 公司);其他试剂为分析纯;盐酸黄柏碱(111895 -201202) 、槲皮素(100081-200907)、大黄素(110756-200110)、大黄酚(110796 -201118)对照品，均购自中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 制备工艺

按处方称取药材，薄荷、乳香、没药3 味水蒸气蒸馏法提取挥发油，收集挥发油备用，药液滤过，浓缩至相对密度1.30 ～1.32(85 ℃)冷却，加乙醇使含醇量为60%，搅匀，静止24 h，取上清液，备用;其他黄柏等4 味加65%乙醇回流提取2 次(10 倍、8倍)，滤过，合并提取液，与上述醇沉液合并，回收乙醇，浓缩至相对密度1.30 ～1.32(85 ℃)，冷却，得清膏。取一定量白凡士林、羊毛脂、白蜂蜡、液体石蜡，加热至熔融，加入上述清膏，混匀，冷却至40 ℃，加入挥发油及十二烷基磺酸钠、尼泊金乙酯、氮酮适量，混匀，冷却至室温，即得。

2.2 薄层色谱鉴别

黄柏:取本品5 g，加1%醋酸甲醇溶液40 mL，超声20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取盐酸黄柏碱对照品，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作为对照品溶液。吸取上述2 种溶液各5 μL，分别点于同一0.2%氢氧化钠硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(30 ∶15 ∶4)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点。见图1 A。

侧柏叶: 取本品15 g，加甲醇20 mL，超声1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取槲皮素对照品，加甲醇制成每1 mL 含0.3 mg 的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液、对照品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5 ∶2 ∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝乙醇溶液，80 ℃加热2 min，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点。见图1 B。

图1 薄层色谱图

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱 柱:ECOSIL C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液(83 ∶17);流速:1 mL/min;柱温:30 ℃;进样体积:10 μL;检测波长:254 nm。理论板数以大黄素峰计算不低于5 000。色谱图见图2。

2.3.2 溶液制备

精密称取大黄素对照品10.47 mg、大黄酚对照品26.29 mg，置100 mL 容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，分别精密量取上述对照品溶适量，加甲醇稀释至一定量，混匀，制得系列对照品溶液，分别含大黄素2.094，4.188，10.47，20.94，31.41，41.88 μg/mL，含大 黄酚5.258，10.516，26.29，52.58，78.87，105.16 μg/mL。取本品约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加10%盐酸溶液10 mL，再加三氯甲烷20 mL，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3 次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣加流动相使溶解，转移至25 mL 容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液即为供试品溶液。取处方量药材(缺大黄)，同法制得缺大黄阴性样品，同法制得缺大黄阴性对照品溶液。

图2 高效液相色谱图

2.3.3 方法学考察

线性关系考察:取上述系列对照品溶液，按拟订色谱条件进样，测定大黄素、大黄酚峰面积，以对照品质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。得大黄素回归方程Y=31 380 X-69，r=0.999 9，结果表明，大黄素质量浓度在2.012 ～50.3 μg/mL 范围内与峰面积呈良好线性关系;大黄酚回归方程Y=44 994 X-229，r=0.999 9，结果表明，大黄酚质量浓度在5.258 ～105.16 μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验:取同一大黄素、大黄酚对照品溶液连续进样6次，依法测定。结果的RSD 分别为0.46%和0.48% ( n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别在0，2，4，8，12 h 时依法进样。结果大黄素、大黄酚含量的 RSD 分别为1.07% 和1.02% ( n=5)，表明供试品溶液在12 h 内稳定。

重复性试验:取同一批样品，精密称定5 份，分别制成供试品溶液，按上述色谱条件进样测定。结果大黄素含量0.364 5 mg/g，RSD 为1.17% ;大黄酚含量为0.922 1 mg/g，RSD 为1.21%( n=5)，表明方法重复性好。

加样回收试验:精密称取已知含量的供试品0.5 g(大黄素0.364 5 mg/g，大黄酚0.922 1 mg/g)，共9 份，分别加混合对照品溶液(大黄素0.104 7 g/L、大黄酚0.266 9 g/L)1，2，3 mL 各3份，依法制备溶液，分析并计算回收率。结果见表1。

2.3.4 样品含量测定

取3 批加味双柏软膏，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定大黄素、大黄酚峰面积，计算含量。结果见表2。

表1 大黄素和大黄酚加样回收试验结果( n=9)

表2 样品中大黄素、大黄酚含量测定结果

3 讨论

加味双柏软膏以黄柏、侧柏叶、大黄为君药，乳香、没药为臣药，共奏活血止痛、清热消肿、散瘀之功，主要用于跌打骨折、扭挫伤筋、跌打损伤早期等病，现代药理作用主要表现为抗炎、镇痛、改善微循环等。现代药理研究表明，侧柏叶具有抗炎作用[1]，主要成分槲皮素有良好的舒张血管、保护内皮功能的作用[2];黄柏能够消除肿胀、改善血管通透性过高，具有抗炎消肿作用，5%黄柏注射液对骨细胞蛋白糖代谢有促进作用[3];大黄具有抗炎、减轻血管损伤后内膜增生病变的形成等作用[4]，大黄素具有抗炎等作用[5-6]。侧柏叶等药主要成分在乙醇中均有较好溶解，故采用乙醇提取法。乳香、没药、薄荷3 药均主含挥发油等成分，故采用水蒸气蒸馏法提取挥发油。加味双柏软膏按文中提取方法，能较好地提取有效成分。

大黄含游离蒽醌和结合型蒽醌，通过盐酸回流水解，得到游离大黄素、大黄酚，再测定含量，能较准确地反映真实含量。通过对大黄素、大黄酚二极管阵列光谱提取分析，大黄素、大黄酚在254 nm 波长附近均有较大吸收峰，且无干扰，故选取254 nm 为检测波长。采用甲醇-水(85 ∶15)，甲醇-水系统虽易平衡、易清洗，但峰形拖尾、理论板较低。采用甲醇-1%磷酸溶液(83 ∶17)作为流动相分离度良好、峰形对称，且其他成分对此无干扰，故选用此流动相。采用TLC 法鉴别侧柏叶、黄柏，斑点清晰;采用HPLC 法测定大黄素、大黄酚的含量，分离度良好，专属性强，且操作简单、结果准确可靠。

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