王震 李凯强 陈秉宇 郝珂 何徐军 牟晓洲 陶厚权 应优敏 张威

●论 著

乌骨藤粗提物对大鼠胶质瘤C6细胞的体外实验研究

王震 李凯强 陈秉宇 郝珂 何徐军 牟晓洲 陶厚权 应优敏 张威

目的 观察乌骨藤粗提取物（MTE）不同组分对大鼠C6胶质瘤细胞增殖情况的影响，探讨其作用机制。方法 采用新型四氮唑盐法（MTS）检测MTE的Fr1、Fr2、Fr3组分对C6细胞增殖的影响；采用流式细胞仪检测Fr2对C6细胞凋亡和周期的影响；采用荧光定量PCR（qPCR）技术检测不同浓度Fr2对C6细胞的Bax、Bcl-2表达的影响。结果 MTE的Fr1、Fr2、Fr3均能显著抑制C6细胞的增殖（P＜0.05），与阳性对照组5-氟尿嘧啶（5-FU）相比抑制率也较高（P＜0.05），其半数抑制浓度分别为：60.32、52.30、83.83μg/ml。经80、160μg/ml的Fr2处理24 h后，可有效促进C6细胞早期和晚期凋亡（P＜0.05），其周期被阻滞在G2期；Fr2相同方式处理后，C6细胞中Bax表达水平分别提高到（124.80±7.68）%和（380.30±6.91）%；Bcl-2表达水平分别降低到（84.20±3.10）%和（34.20±4.80）%（P＜0.05）。结论 MTE能够显著抑制C6胶质瘤细胞的增殖，其中主要有效成分Fr2能够诱导C6细胞发生G2期周期阻滞，并通过影响Bax和Bcl-2的表达，促进其凋亡。

乌骨藤粗提物 增殖 大鼠胶质瘤 C6细胞

脑胶质瘤为常见颅内原发性肿瘤，已报道的44.6%颅内肿瘤为脑胶质瘤[1]。目前胶质瘤的治疗手段主要采用手术配合放化疗的综合治疗方式。由于胶质瘤呈浸润性生长，术后复发率高，因此，寻找安全、有效的新治疗手段是目前迫切需要解决的问题。乌骨藤为萝藦科牛奶菜属植物，具有抗肿瘤、平喘、免疫调节和降血压等药理作用。乌骨藤的粗提物（MTE）为主要成分的药物“消癌平”临床上用于治疗肝癌、胶质瘤、胃癌等恶性肿瘤[2-3]。但由于MTE抗胶质瘤的作用机制尚不清楚，为进一步分离纯化乌骨藤，探索其抗胶质瘤作用机制，对推进以乌骨藤为主要成分的临床中药制剂的减毒增效具有重要价值，笔者采用新型四氮唑盐法（MTS）检测不同的MTE组分（Fr1、Fr2、Fr3）对C6胶质瘤细胞的抑制率，流式细胞技术检测MTE组分对C6细胞增殖、凋亡和周期的影响，RT-qPCR技术检测MTE组分对C6细胞中Bax、Bcl-2表达的影响，从而探索MTE是否影响胶质瘤C6细胞及其影响机制。

1 材料和方法

1.1 细胞培养 将大鼠胶质瘤细胞C6细胞系（由浙江省人民医院临床研究中心提供）培养于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基（美国 Invitrogen公司）中，在37℃、饱和湿度、含5%CO2、100U/ml青霉素/链霉素的培养箱内培养。48～72h传代，采用0.25%胰酶消化，1∶3传代后，取对数生长期细胞进行进一步实验研究。

1.2 MTS MTE经萃取和色谱分离，获得3个主要有效组分Fr1、Fr2和Fr3（由浙江工业大学药学院纯化和提供）。将Fr1、Fr2和Fr3溶于二甲基亚砜（DMSO）配成高浓度的储存液，分别使用20、40、80、160、320μg/ml的MTE处理C6细胞24h，阳性对照组采用8 000μg/ ml的5-氟尿嘧啶（5-FU）；采用MTS法测定不同浓度MTE对体外培养C6细胞增殖的影响，并根据吸光度（OD）值计算细胞增殖抑制率作图得到剂量-效应图谱[2]。实验重复3次，取3次实验数据的平均值；并计算半数抑制浓度（IC50）值。

1.3 流式细胞术检测细胞凋亡和周期 由于前期工作中已知Fr2组分含较多新的有效单体，选Fr2活性组分先进行研究。分别使用 0.10%DMSO、80μg/ml和160μg/ml Fr2处理C6细胞24h，使用流式细胞术（美国BD公司）检测3组C6细胞凋亡和周期的差异[3]。

1.4 RT-qPCR检测 分别使用0.10%DMSO、80μg/ml和160μg/ml的Fr2处理C6细胞24h，抽提总RNA（美国Invitrogen公司），以50ng作为模板，使用RT-qPCR法，以SYBR Green I作为染料。滴加20μl反应液（表1），对Bax、Bcl-2表达水平进行检测。以DMSO组为参照获得循环阈值（Ct），计算MTE组Bax、Bcl-2表达水平的变化，引物序列详见表2。

表1 RT-qPCR反应体系的配置（μl）

1.5 统计学处理 采用Prizm 5统计软件。计量资料以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

表2 RT-qPCR法引物序列

2 结果

2.1 MTE对抑制C6细胞增殖的影响 Fr1、Fr2、Fr3组分C6细胞的IC50分别为60.32、52.30、83.83μg/ml。20、40、80、160和320μg/ml MTE和阳性对照组抑制率[（26.15±1.19）%]均高于0μg/ml MTE组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），且随MTE浓度的升高，其抑制率逐渐增强，详见表3。

表3 MTE对抑制C6细胞增殖的影响（%）

2.2 MTE中Fr2对C6细胞周期的的影响 DMSO对照组，G1（72.47±2.36）%，S（21.42±2.55）%，G2（6.10±0.52）%；80μg/ml组，G1（65.12±1.65）%，S（21.75±1.19）%，G2（13.12±1.01）%；160μg/ml组，G1（58.64±1.91）%，S（27.22± 1.92）%，G2（14.14±1.57）%；Fr2组的G1和 G2期与DMSO对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），且Fr2组的G2期随着药物浓度的升高具有增加趋势，细胞被阻滞在G2期，详见图1。

2.3 MTE中Fr2对C6细胞凋亡的影响 DMSO对照组、80μg/ml和160μg/ml Fr2组C6细胞的早期凋亡率分别为（4.77±0.88）%、（5.91±0.56）%、（18.45±0.85）%；晚期凋亡率分别为（3.90±0.12）%、（7.68±1.05）%、（31.07±1.80）%；与DMSO对照组比较，Fr2组的早期凋亡率和晚期凋亡率差异有统计学意义，Fr2组的凋亡率随着Fr2浓度提高而提高（P＜0.05），详见图2。

2.4 Fr2对Bax和Bcl-2表达水平的影响 DMSO处理后Bax、Bcl-2的Ct值分别为22.02±0.28和27.72± 0.41，标准化后经80、160μg/ml Fr2处理，C6细胞的Bax表达水平提高到（124.80±7.68）%、（380.30±69.10）%，Bcl-2表达水平减低到（84.20±3.10）%、（34.20±4.80）%（均P＜0.05）。

图1 MTE中Fr2对C6细胞周期的影响（A：DMSO对照组；B：Fr2 80μg/ml MTE组；C：Fr2 160μg/ml MTE组）

图2 MTE中Fr2对C6细胞凋亡的影响（A：DMSO对照组，B：Fr2 80μg/ml Fr2组，C：Fr2 160μg/ml Fr2组）

3 讨论

脑胶质瘤易转移，易产生耐药，是中枢神经发病率最高的脑肿瘤。目前，对神经胶质瘤的治疗不能完全按照常规肿瘤治疗方式，这是因为胶质瘤生长在一个相对分化成熟的区域，且受到血脑屏障的保护，常规化疗药物很难到达胶质瘤部位，这在很大程度上限制了胶质瘤的治疗。低毒高效的天然小分子药物易于穿透血脑屏障，而表现出独特的治疗优势[4-5]。

乌骨藤是一类萝藦科牛奶菜属植物，具有止咳平喘、养胃散结之效，既往常用于保肝利尿药效的应用。近年来，有学者提出，乌骨藤在免疫调节、败毒抗癌中的功效有望应用于各类恶性肿瘤的治疗，并在临床研究中证实了其联合放化疗的良好效果[6]。然而，目前关于乌骨藤对于癌细胞的作用机制研究尚不深入。故本研究中，采用乌骨藤提取物在体外实验中研究它们对大鼠胶质瘤C6细胞增殖有无抑制作用，对肿瘤的凋亡有无促进作用，期望为今后开发治疗肿瘤药物奠定实验基础。

本研究应用自己提纯的MTE作用于C6细胞的研究发现，不同MTE组分对C6细胞IC50均明显低于阳性对照，其中Fr2组分抑制效果最好，随着Fr2组分作用时间、浓度的提高，C6细胞增殖能力抑制越明显，细胞的核分裂象减少程度也更明显，进一步的研究发现，经Fr2组分处理后，C6细胞的G1期显著减少，而G2期受到了明显阻滞，且随着浓度的提高早期和晚期凋亡加剧。qPCR实验中，笔者发现经Fr2组分处理后C6细胞Bcl-2的表达水平显著下调，且随浓度提高而下降；Bax的表达水平显著上调，随Fr2组分浓度提高而提高。众所周知，癌基因Bcl-2由于染色体易位(14，18)导致14号染色体上的免疫球蛋白重链基因（IgH）与18号染色体上的Bcl-2的融合[7]，从而使Bcl-2过表达，通过将细胞阻滞在G0/G1期而抑制细胞凋亡，促进肿瘤生长和演进[8]。而Bax相反，它的表达提高阻碍肿瘤进展及恶性转化，这体现了中枢神经系统来源的肿瘤在生物学行为及临床上的多样性[9]。通过抑制Bcl-2和提高Bax的表达量，解除G1其阻滞，促进细胞凋亡，而这一结果与流式检测细胞周期与凋亡的现象一致，进一步明确MTE抑制C6细胞的作用机制。同时，细胞凋亡的诱导有助于机体正常内环境的恢复与稳定，凋亡抑制基因的高表达以及促凋亡基因的突变或表达降低被认为是肿瘤发生和增殖的重要原因，在抑制肿瘤形成、降低其生长速度及改善患者预后方面均有着重要意义[10]。

综上所述，乌骨藤制剂能够明显抑制胶质瘤C6细胞Bax，Bcl-2的表达，提示乌骨藤制剂将有可能通过调节细胞周期，促进细胞凋亡而发挥抗肿瘤的目的。该研究对于筛选有益的传统中药抗癌成分，丰富中药的药理理论具有重要的意义，对今后科学提取和使用乌骨藤抗肿瘤活性成分具有指导价值，有待更深入的研究。

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Effect of Marsdenia tenacissima extract on proliferation of rat C6 glioma cells in vitro

WANG Zhen,LI Kaiqiang,CHEN Bingyu,et al.
Department of Blood Transfusion,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

Objective To investigate the effect of Marsdenia tenacissima extract(MTE)on proliferation of rat glioma C6 cells. Methods A new tetrazolium salt reduction method(MTS)was used to measure the effect of Fr1,Fr2,Fr3 component from MTE on C6 cell proliferation,flow cytometry was applied to measure cell apoptosis and cell cycle,real-time quantitative PCR(qPCR)was used to detect Bax and Bcl-2 gene expression in C6 cells treated by Fr2 with different concentrations. Results Fr1,Fr2 and Fr3 of MTE significantly inhibited the proliferation of C6 cells(P＜0.05),the inhibition rate was higher than that of 5-fluorouracil(5-FU)(P＜0.05),and the 50%inhibitory concentrations were 60.32μg/ml,52.30 μg/ml,and 83.83μg/ml,respectively.After treated with 80 μg/ml and 160μg/ml of Fr2 for 24h,early and late apoptosis of C6 cells were both promoted(P＜0.05),and the cell cycle was arrested at G2phase;Bax gene expression was increased to (124.80± 7.68)%and(380.30±6.91)%;Bcl-2 gene expression was reduced to(84.20±3.1)%and(34.20±4.80)%,respectively(P＜0.05). Conclusion This study suggests that MTE can significantly inhibit the proliferation of C6 glioma cells, and the main active ingredient Fr2 can induce G2phase cycle arrest and promote apoptosis,which were associated with changes of Bax and Bcl-2 gene expression.

Marsdenia tenacissima extractProliferation Rat glioma C6 cell line

2015-01-05）

（本文编辑：严玮雯）

浙江省自然科学基金（LY15H280003、LY15C090004）；浙江省中医药科技计划项目（2014ZB007、2014ZQ005）

310014 杭州，浙江省人民医院输血科（王震、李凯强、陈秉宇、郝珂），临床研究中心（何徐军、牟晓洲、陶厚权），胃肠外科（张威）；浙江工业大学药学院（应优敏）

，张威，E-mail：mmizjpph88@163.com