■朱雪飞 王金荣 尹艳丽 陈培英 赵银丽 苏兰利

（河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001）

苜蓿是一种优质的豆科牧草，在我国有着2 000多年的种植历史。到2012年，中国苜蓿的种植面积约为133万公顷。苜蓿的蛋白质含量很高，青饲料中粗蛋白质含量为15%～25%[1]，氨基酸组成全面均衡，容易被草食家畜转化利用[2]，是优良的蛋白饲料原料，具有“牧草之王”的美称[3]。近年来，我国的蛋白质饲料原料资源缺乏，开辟新的植物蛋白质资源是解决蛋白质饲料短缺的途径之一，苜蓿作为一种优良的蛋白饲料资源，提高苜蓿蛋白质的利用率对解决蛋白饲料资源短缺具有积极的意义[4]。

虽然苜蓿是一种优良的蛋白质资源，但其纤维素含量较高，适口性差，目前多采用微生物发酵法改善苜蓿草粉的品质，提高蛋白质的产量。微生物发酵法是一种常用的改善饲料原料品质，提高蛋白质含量的方法。Hong等采用米曲霉固态发酵豆粕，结果表明所得的发酵产品中粗蛋白质的含量有明显增加，并且胰蛋白酶抑制剂降解率高达84.44%[5]。曲敏等在采用嗜酸乳杆菌发酵制备苜蓿叶蛋白的研究中得到叶蛋白的提取率为14.90%，叶蛋白中粗蛋白质的含量为45.08%[6]。酵母菌能够在发酵过程中分泌大量水解酶类，利用无机氮源和碳水化合物合成微生物蛋白，降解抗营养因子，并产生生物活性物质。利用酵母菌发酵的豆粕有抗病、强化营养和促进生长的效果[7-8]。本试验拟采用啤酒酵母进行单因素发酵试验，在此基础上，采用响应面分析法对发酵条件进行优化，最终得到最佳的发酵条件，以期改善苜蓿草粉的品质，降低粗纤维含量，提高苜蓿蛋白质的含量。

1 材料和方法

1.1 试验设计

本试验首先采用单因素试验，以发酵后苜蓿粉中的粗蛋白质含量及真蛋白质含量为检测指标，筛选出最适的料水比、发酵温度、接种量及发酵时间；在单因素试验的基础上采用3因素3水平响应面分析法对发酵条件进行优化，以发酵后粗蛋白质含量的增加量为检测指标，确定出最佳发酵条件。

1.2 试验材料

1.2.1 发酵菌种

试验所用啤酒酵母菌株来自于河南工业大学生物工程学院发酵工程实验室。

1.2.2 培养基

菌种活化培养基（PDA培养基）：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 ml，pH自然。将马铃薯洗净去皮，切成小块，加水煮烂，经8层纱布过滤，加入蔗糖，琼脂，待琼脂完全溶解后，121℃灭菌25 min。

种子液培养基（PDA液体培养基）：马铃薯200 g，蔗糖20 g，蒸馏水1 000 ml，pH自然。将马铃薯洗净去皮，切成小块，加水煮烂，经8层纱布过滤，加入蔗糖，121℃灭菌25 min。

1.2.3 苜蓿

本试验所用的紫花苜蓿均采集于河南农业大学科学实验基地。将苜蓿自然晾晒干燥后粉碎成草粉备用。

1.2.4 试剂及仪器

试剂：硼酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；氢氧化钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）；盐酸（洛阳昊华试剂有限公司）；硫酸（洛阳昊华试剂有限公司）；蔗糖（天津市科密欧化学试剂有限公司）；琼脂粉（天津市科密欧化学试剂有限公司）；硫酸铜（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；丙酮（天津市科密欧化学试剂有限公司）等。

仪器设备：DNP-9082型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；K9840自动凯氏定氮仪（济南海能仪器股份有限公司）；SH220石墨消解仪（济南海能仪器股份有限公司）；电炉；马弗炉等。

1.3 试验方法

1.3.1 啤酒酵母菌种活化及培养

菌种活化：将保存于冰箱中的斜面菌种接种于PDA固体培养基上，28℃恒温培养24 h。

种子液制备：将培养24 h的菌种接种于液体菌种培养基中，28℃，120 r/min条件下震荡培养14 h。

啤酒酵母生长曲线测定：取适量菌种接种于液体PDA培养基中，28℃，120 r/min培养，每隔3 h取样测定OD600nm值，以时间为横坐标，OD600nm值为纵坐标绘制啤酒酵母的生长曲线。

1.3.2 发酵条件优化

1.3.2.1 单因素试验设计

以料水比、发酵温度、接种量及发酵时间为因素进行单因素发酵试验，以粗蛋白质和真蛋白质为检测指标。

采用苜蓿草粉为培养基，调节初始料水比为：1∶0.8、1∶1.2、1∶1.5和1∶1.8，其它条件不变进行发酵；分别选择25、28、31、34 ℃为发酵温度，在其它条件不变的情况下进行发酵；将培养好的种子液按数量级为106、107、108和109cfu/g进行接种，其它条件不变进行发酵；将发酵条件分别设定为36、72、108、144 h，在其它条件不变的情况下进行发酵，发酵结束后测定粗蛋白质和真蛋白质的含量。根据所测粗蛋白质和真蛋白质含量的高低，确定各个因素的最佳试验水平。

1.3.2.2 响应面分析

在单因素试验的基础上，采用SAS 9.0软件，根据Box-Benhnken试验设计原理，选取对于发酵结果影响较大的料水比、发酵温度和发酵时间为因素，设计3因素3水平的响应面分析试验。建立各因素与粗蛋白质增加量之间的数学模型，通过分析得到最佳发酵条件。

1.3.3 各指标检测方法

样品的制备：发酵结束后，65℃风干8 h，在空气中回潮，粉碎，过40目筛。

粗蛋白质根据GB/T6432-1994测定；真蛋白质的检测是先将蛋白质沉淀，除去非蛋白含氮物质，再用凯氏定氮法测定[9]；粗纤维参照张丽英的滤袋技术在饲料纤维素分析中的应用检测[10]。

1.3.4 数据处理

在本试验中，对于单因素试验的数据采用SAS 9.0软件，单因素方差分析中的Duncan's multiplerange test多重比较法进行分析。在响应面试验中，采用SAS 9.0软件，Box-Benhnken试验设计原理进行试验设计，对响应面试验结果进行多元线性回归分析。

2 结果与分析

2.1 啤酒酵母生长曲线的测定

以生长时间为横坐标，OD600nm为纵坐标绘制啤酒酵母的生长曲线，如图1所示。啤酒酵母在培养6 h后，OD值快速上升，菌株进入对数期；在15 h到18 h中间，OD值逐渐平稳，菌株进入稳定期。因为在对数期接种相对较好，所以，选择在14 h进行接种。

图1 啤酒酵母的生长曲线

2.2 啤酒酵母发酵苜蓿工艺参数的优化

采用单因素试验筛选啤酒酵母发酵苜蓿粉工艺参数，选择料水比、发酵温度、接种量及发酵时间为试验变量，以测定粗蛋白质及真蛋白质含量为参考指标，确定各因素在发酵过程的影响规律及最佳水平范围。

2.2.1 料水比对发酵的影响（见表1）

表1 料水比对发酵苜蓿中粗蛋白质及真蛋白质含量的影响（%）

由表1可知，随着培养基含水量的增加，粗蛋白质和真蛋白质的含量也在逐渐的增加，当料水比为1∶1.5时，粗蛋白质的含量达到26.21%，真蛋白质含量为21.18%，高于其它的试验组，故选择合适的料水比为1∶1.5。

2.2.2 发酵温度对发酵的影响（见表2）

表2 发酵温度对发酵苜蓿中粗蛋白质及真蛋白质的影响（%）

通过表2可见，随着发酵温度的增加，粗蛋白质及真蛋白质均在28℃达到最大值26.73%及22.73%。结合发酵后苜蓿草粉中粗蛋白质及真蛋白质含量的变化可知，当发酵温度为28℃时高于其它各组，所以选择的适宜的发酵温度为28℃。

2.2.3 接种量对发酵的影响（见表3）

表3 接种量对发酵苜蓿中粗蛋白质及真蛋白质的影响（%）

由表3可见，随着接种量的增加，粗蛋白质的含量增加，当接种量为108cfu/g时，粗蛋白质的含量为26.59%，高于其它的接种量组。真蛋白质在接种量为109cfu/g时，达到最大，综合真蛋白质和粗蛋白质的含量变化，所以，选择接种量为108cfu/g较为适宜。

2.2.4 发酵时间对发酵的影响（见表4）

表4 发酵时间对发酵苜蓿中粗蛋白质及真蛋白质的影响（%）

由表4可见，随着发酵时间的增长，粗蛋白质的含量呈现先增加后降低的趋势，在108 h最高为26.73%，真蛋白质的含量随着发酵时间的增加一直增加。结合粗蛋白质及真蛋白质二者含量的变化可知，选择较为适宜的发酵时间为108 h。

2.3 响应面发酵条件优化

2.3.1 响应面试验设计及结果分析

根据单因素试验的结果，选取对发酵结果影响较大的料水比、发酵温度及发酵时间为因素，每个因素取3个水平，进行响应面分析设计，进一步优化各因素的参数值。各因素水平的编码表见表5，试验设计及结果见6。

利用SAS 9.0软件对表6中的响应面设计试验结果进行分析，响应面结果分析见表7。回归模型极显著(P=0.000 261＜0.01)。并可得到二次多元回归方程：Y=4.276 667+0.165X1+0.73X2+0.247 5X3-0.417 083X12-0.302 5X1X2+0.002 5X1X3-0.842 083X22-0.322 5X2X3-0.577 083X32。失拟项P=0.167 237＞0.05不显著，说明模型适当，回归方程拟合度良好。回归方程的复相关系数为0.988 4，校正系数为0.967 6，表明该模型对粗蛋白质的增加量可以96.76%的解释。X1，X2，X3的P值均小于0.05，表明料水比、发酵时间和发酵温度对苜蓿发酵过程中粗蛋白质含量的变化有显著的影响，其中发酵时间和发酵温度的影响较大。

表5 试验设计因素水平及编码

表6 Box-Benhnken响应面试验设计及结果

表7 响应面结果方差分析

对回归方程求一阶偏导数，整理方程组得：X1=0.051 3，X2=0.404 8，X3=0.101，将X1、X2、X3代入回归方程，得到预测粗蛋白质增加量最大值为4.44%，也就是粗蛋白质含量为26.81%。由X1、X2、X3整理得啤酒酵母发酵苜蓿的最佳条件为料水比1∶1.52，发酵时间为122.6 h，发酵温度为28.3℃。

2.3.2 模型的验证

为了验证模型的有效性，对响应面优化得到的最佳条件，即料水比1∶1.52，发酵时间122.6 h，发酵温度28.3℃进行试验，重复3次，测得粗蛋白质的含量为26.65%，与预测值26.81%接近，相对误差为0.60%。可见该模型可以有效地提高苜蓿粗蛋白质的含量。

对采用最佳条件发酵的苜蓿草粉进行纤维素的检测，测得发酵后的苜蓿粉纤维素含量为15.73%，比未经发酵的苜蓿纤维素含量19.30%降低了18.50%。这对于苜蓿草粉粗纤维含量高，适口性差，有较好的改善。

3 讨论

本试验通过对啤酒酵母固态发酵苜蓿的工艺进行研究，建立了关键影响苜蓿粗蛋白质增加量的各因素间的二次多项数学模型：Y=4.276 667+0.165X1+0.73X2+0.247 5X3-0.417 083X12-0.302 5X1X2+0.002 5X1X3-0.842 083X22-0.322 5X2X3-0.577 083X32，确定了啤酒酵母固态发酵苜蓿的工艺条件。测得经啤酒酵母发酵后粗蛋白质的含量为26.65%，比未发酵时粗蛋白质含量提高19.13%，这与刘照娟采用啤酒酵母发酵苜蓿草粉时粗蛋白质含量相符合[11]。

在进行料水比、发酵温度、接种量以及发酵时间对发酵效果的影响时，料水比、发酵温度以及发酵时间对于发酵结果的影响较大。

料水比过高过低，对于蛋白质和真蛋白质的含量均有影响，其主要原因是当培养基的含水量过高，通透性不好，会影响微生物的生长和代谢，影响发酵结果，进而影响粗蛋白质及真蛋白质的含量；当培养基含水量过低会影响微生物对营养物质的利用，进而影响微生物生长和代谢。这与严鹤松的试验在发酵过程中料水比过高过低均会影响发酵豆粕粗蛋白质的含量的结果一致[12]。

不同的微生物都会有其最适的生长温度，高于或者低于最适温度，微生物的生长和代谢都会受到影响，从而影响发酵结果。从吴胜华等采用啤酒酵母单菌发酵豆粕的研究中可知，高于或低于最适生长温度对胰蛋白酶抑制因子和小肽的含量均有影响[13]。

随着接种量的增加，粗蛋白质的含量先增加，到接种量为108cfu/g时，达到最大，稍后，稍微有减少，但效果不是太明显，这是因为接种量过大导致培养基中的营养物质消耗过快，代谢副产物积累，从而影响微生物的生长，影响发酵结果[14]。

在本试验中，粗蛋白质的含量增加，是因为微生物的生长要利用吸收培养基中的营养物质，随着营养物质的吸收利用，培养基的相对质量减少，而氮的总量不变，从而使粗蛋白质的含量相对增加。

4 小结

通过本试验可以得到啤酒酵母固态发酵苜蓿提高粗蛋白质含量的最优条件为：料水比：1∶1.52，发酵时间为122.6 h，发酵温度为28.3℃，粗蛋白质的含量为26.81%；通过验证试验，测得粗蛋白质的含量为26.65%，与理论预测值相比，相对误差为0.60%，发酵后的苜蓿粉纤维素含量为15.73%，比未经发酵的苜蓿纤维素含量19.30%降低了18.50%。试验结果表明该模型能够使粗蛋白质的含量相对增加，纤维素的含量相对降低，对于改善苜蓿粉品质，提高蛋白质的产量有较好的效果。