姜佳佳 孙文广 屠越华 阎雅更 董凤丽 葛 声

5 -FU 是胃癌化学治疗常用的一种细胞毒性药物，但其对患者产生的毒性不良反应及耐药性问题使其临床功效及应用受到很大的限制，因此临床以联合应用多见［2～6］。

生育三烯酚是维生素E 的一种亚型，目前其对多种肿瘤细胞系的抗增殖作用及其与某些药物联合的增敏作用已见报道，但γ -T3 与5 -FU 联合应用对胃癌SGC-7901 细胞系的增殖抑制作用却未曾报道［7～9］。因此，本研究探讨了γ -T3 与5 -FU 联合应用对SGC-7901 细胞系增殖抑制的作用。

材料与方法

1.材料:γ -T3，纯度95%，溶于无水乙醇，购于美国Hygeia 公司。人胃癌细胞系SGC -7901，购自北京市肿瘤研究所。使用含10% 胎牛血清1% 青链霉素，1% 谷氨酰胺的RPIM 1640 培养液于37℃，5% CO2恒温条件下培养，使用0.02%的EDTA 消化传代。CCK -8 购于日本同仁化学研究所，AnexinⅤ-FITC 细胞凋亡试剂盒购于美国BD 公司。

2.方法:(1)细胞增殖抑制试验(CCK -8 法):将对数生长期细胞按照每孔200μl 培养液(10%FBS)，5000 个细胞接种于96 孔板，后置于37℃，5%CO2培养箱内培养，待24h 后，按照分组方式换成含有不同浓度的γ -T3 和5 -FU 的10%胎牛血清培养液，继续培养，于48h 后分别加入CCK -8 检测液用酶标仪测其吸光度值。(2)流式细胞分析:取对数生长期细胞制成细胞悬液，按照每孔2ml 培养液，3.0 ×104个细胞，种于6 孔板中，用10%FBS 培养液种板，24h 后，换成含有不同浓度的γ-T3 和5 -FU 的2%胎牛血清培养液，继续培养48h 后，进行凋亡检测前处理加入FITC 和PI 染色剂进行染色，之后上机检验。

结 果

1.细胞增殖抑制实验结果:5 -FU 和γ-T3 均可抑制SGC-7901 细胞的增殖，并随着浓度的增加抑制作用增强，(P ＜0.05，图1 中A、B)，增殖抑制作用呈明显的剂量效应关系;而γ-T3(20 或30μmol/L)+5-FU 联合应用与5-FU 单药组相比对SGC-7901 细胞的增殖抑制作用增强(图1C)，有增效作用，其差异有统计学意义(t = -3.57，P =0.005;t = -6.856，P =0.000)。通过CDI 值计算结果可以看出，CDI 值均＜1(表1)，说明两药联合的抗肿瘤作用为协同作用。

2. 流式细胞术细胞凋亡实验结果:5 - FU(30μmol/L)单独用药组凋亡率(7.9% ±0.9%)、T3(20μmol/L)单独用药组凋亡率(38.7% ±1.2%)和5-FU(30μmol/L)+γ -T3(20μmol/L)联合用药组凋亡率(49.4% ±2.2%)与对照组(3.9% ±0.7%)相比差异均有统计学意义(P ＜0.01)，详见图2、图3。

讨 论

图1 不同药物不同浓度下SGC-7901 细胞CCK-8 增殖抑制率

表1 5 -FU、γ-T3 及5 -FU+γ-T3 对SGC-7901细胞系生存指数的影响及其CDI 值

5 -FU 是胃癌治疗的常用药物之一，但是随着治疗的深入，其耐药性及不良反应的增加也成为一个重要的治疗难题［6］。因此，如何提高5 -FU 敏感度，减少耐药性和不良反应就成为临床上需要迫切解决的问题［2～6］。研究表明，生育三烯酚对多种肿瘤细胞具有增殖抑制与诱导凋亡的作用，而对正常组织上皮细胞不具有明显毒性不良反应［7，8，10］，因此，生育三烯酚被认为是一种非常有前途的潜在抗癌剂［4］。

图2 不同药物浓度SGC-7901 细胞凋亡情况

图3 不同药物浓度下SGC-7901 细胞凋亡率

本实验的结果证明了γ-T3 与5 -FU 单独应用与对照组相比对SGC-7901 细胞具有抑制增殖的作用，并随着剂量的增加，抑制率也有明显地增高。两药联合应用与其单独应用相比对肿瘤细胞的抑制率具有明显的升高，这与Guligena 等发表γ-T3 与抑制素类的SMV 和ATV 联合应用与其分别单独用于两种间皮瘤细胞系与空白对照比较产生了非常明显的生存抑制作用的结果相同［11～17］。本实验通过计算国际通用的两药相互作用系数CDI 来确定两药联合应用是否是协同作用，当CDI ＜1、=1、＞1 时，分别说明两药联合是协同作用、相加作用和拮抗作用［1］。本次联合用药实验CDI ＜1 则表明5 -FU 与生育三烯酚联合是协同作用，其差异有统计学意义。联合用药增加了胃癌细胞系SGC -7901 的凋亡比率，比对照组和单独用药组有更强的凋亡诱导作用。

以上研究结果表明γ-T3 与5 -FU 联合应用与其分别单独应用同对照组相比对SGC -7901 细胞的增殖抑制作用具有明显增效作用，并且其抑制作用可能与其促进细胞凋亡有关。

1 Chou TC，Talalay P. Quantitative analysis of dose - effect relationships:the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitiors.Adv Enzyme Regul，1984，22:27 -55

2 Zhang N，Yin Y，Xu SJ，et al.5 -Fluorouracil:Mechanisma of Resistance and Reversal Strategies［J］.Molecules，2008，13:1551 -1569

3 刘洁. LY294002 对胃癌5 -氟尿嘧啶化疗增敏作用及研究机制研究［D］.武汉:武汉大学，2011

4 黎伯培，陈俊强，刘金禄. 胃癌耐药细胞株SGC -7901/5 -FU 的建立及其耐药机制的初步探讨［J］.消化肿瘤杂志，2012，4:163 -169

5 孙根林，鲍扬漪.1，25(OH)2维生素D3和塞莱昔布协同对5 -FU 化疗的增敏作用［J］.医学研究杂志，2010，39(10):74 -77

6 邢国辉，冯玉光，宗绪山.丹参酮ⅡA 联合5 -FU 对低氧下人胃癌SGC7901 细胞增殖、凋亡的影响及与HIF-1α 和突变型P53 表达的关系［J］世界华人消化杂志，2012，18(3):222 -228

7 KA Manu，MK Shanmugam，Lalitha Ramachandran，et al.First Evidence That γ - Tocotrienol Inhibits the Growth of Human Gastric Cancer and Chemosensitizes It to Capecitabine in a Xenograft Mouse Model through the Modulation of NF-κB Pathway［J］. Clin Cancer Res，2012，18:2220 -2229

8 Amirah Abdul Rahman，A Rahman A Jamal，Roslan Harun，et al.Gamma- tocotrienol and hydroxyl - chavicol synergisitically inhibits growth and induces apoptosis of human glioma cells［J］. BMC Complement＆Alternative Medicine，2014，14:213

9 Margarita González - Vallinas，Susana Molina，Gonzalo Vicente，et al.Antitumor effect of 5 -fluorouracil is enhanced by rosemary extract in both drug sensitive and resistant colon cancer cells［J］. Pharmacological Research，2013，72:61 -68

10 NM Ayoub，MR Akl，PW Sylvester. 2013:Combined γ - tocotrienol and Met inhibitor treatment suppresses mammary cancer cell proliferation，epithelial - to - mesenchymal transition and migration［J］. Cell Prolif，2013，46:538 -553

11 FA Behery，MR Akl，Suryatheja Ananthula，et al.Optimization of tocotrienols as antiproliferative and antimigratory leads［J］. European Journal of Medicinal Chemistry，2013，56:329 -341

12 Chen D，Jiao XL，Liu ZK，et al. Knockdown of PLA2G2A sensitizes gastic cance cells to 5 -FU in vitro［J］. European Review for Medical and Pharmacological Sciences，2013，17:1703 -1708

13 Yap WN，Chang PN，Han HY，et al.Gamma-tocotrienol suppresses prostate cancer cell proliferation and invasion through multiple -signalling pathways［J］. Br J Cancer，2008，99(11):1832 -1841

14 Guligena Tuerdi，Saki Ichinomiya，Hiromi Sato，et al. Synergistic effect of combined treatment with gamma - tocotrienol and statin on human malignant mesothelioma cells［J］. Cancer Letters，2013，339:116 -127

15 MR Akl，NM Ayoub，PW Sylvester.Mechanisms Mediating the Synergistic Anticancer Effects of Combined γ - Tocotrienol and Sesamin Treatment［J］.Original Papers，2012，78:1731 -1739

16 AB Shirode，PW Sylvester.Synergistic anticancer effects of combined γ-tocotrienol and celecoxib treatment are associated with suppression in Akt and NFκB signaling［J］.NIH Public Access，2010，64(5):327-332

17 Paul W，Sylvester.Synergistic anticancer effects of combined c-tocotrienol with statin or receptor tyrosine kinase inhibitor treatment［J］.Genes Nutr，2012，7:63 -74