王占一， 戴 博， 王玉海， 张立华， 李卓瓦， 毕海丹

（1.枣庄学院生命科学学院，山东枣庄277160；2.空军总医院药学部，北京100142）

石榴皮多糖提取过程的动力学分析

王占一1， 戴 博2， 王玉海1， 张立华1， 李卓瓦1， 毕海丹1

（1.枣庄学院生命科学学院，山东枣庄277160；2.空军总医院药学部，北京100142）

目的以动力学模型分析热水浸提石榴皮多糖的参数值。方法石榴皮石油醚脱脂后不同温度条件下进行恒温提取多糖，以总糖和还原糖为检测指标，求解提取动力学的速率常数k、相对萃余率、表面扩散系数DS、表观活化能Ea和半衰期t1/2等数值。结果石榴皮多糖提取过程的动力学基本符合一级动力学方程。提取系统温度越高，石榴皮多糖质量浓度达到平衡所需要的时间越短，k值和DS值呈现逐渐增大的趋势，相对剩余量下降越快，Ea值大体上呈现下降趋势，t1/2值均随之减小。结论所得石榴皮多糖提取动力学参数值提示溶质的内扩散为浸提过程的关键控制步骤。

石榴皮；多糖；提取；动力学分析

石榴Punica granatuML.又名山力叶、若榴木，其果皮干燥品入药称为石榴皮。石榴皮是最常用的中药材品种之一，早在南北朝时期 《雷公炮炙论》中就有记载。多糖是石榴皮中一类重要的化学成分［1］，越来越多的研究证明其具有复杂的多方面的生物活性和功能。柯春林等［2］研究发现石榴皮多糖具有很强的还原能力和清除羟自由基的活性，李左龙等［3］研究发现石榴皮多糖能显著提高实验小鼠免疫器官质量及巨噬细胞的吞噬能力。

目前，对于石榴皮多糖提取方面的研究仅限于简单的工艺优化设计［2，4］，而对于石榴皮多糖提取过程动力学研究很少。建立一个可信度较高的提取过程动力学模型，不仅可以全面地研究提取过程机理，也为提高石榴皮多糖的提取效率，以及后期中试生产工艺设备设计提供参考，从而有效节约生产成本、提高经济效益［5-7］。此外，以往天然产物提取动力学模型的研究对象大多数为小分子物质，本实验研究对象为石榴皮多糖这类大分子物质，对于大分子物质是否可以应用常用动力学模型来研究，以及模型适应程度如何，这些都是崭新的研究内容。鉴于此，本研究以经典Fick第二定律为基础的动力学数学模型来探讨石榴皮多糖提取的动力学参数。

1 材料与试剂

石榴皮干燥品，购自枣庄市农贸市场，经枣庄学院生命科学学院李思建副教授鉴定为正品石榴皮；葡萄糖对照品 （批号 110833-201205，规格100 mg，纯度＞99%），由中国食品药品检定研究院提供；浓硫酸、苯酚、3，5-二硝基水杨酸、石油醚、氢氧化钠、亚硫酸钠、蒸馏水等均为分析纯。

2 仪器与设备

8453型紫外-可见光分光光度计（美国Agilent公司）；DK-S26型数显恒温水浴锅 （上海三发科学仪器有限公司）；SHB-ⅢA型循环水式多用真空泵 （郑州长城科工贸有限公司）；AR1140型电子分析天平 （美国奥豪斯国际贸易有限公司）；DHG-9141A型电热恒温干燥箱 （上海精宏实验设备有限公司）。

3 试验方法

3.1 石榴皮多糖的提取方法

3.1.1 石榴皮多糖的提取工艺流程 精密称取10 g石榴皮干燥颗粒 （半径R约为0.03 cm），共计20份，分别置于20只干燥三口烧瓶中，均用一定量石油醚脱脂后，将20只三口烧瓶随机分为4组，每组5只。再以小组为单位，分别加入不同体积 （50、100、150、200 mL）已经预热到规定温度的蒸馏水，不停搅拌，在不同温度条件下（318、328、338、348、358 K）进行恒温提取，操作进行30 min后，每隔30 min取样0.1 mL，进行石榴皮多糖的质量浓度测定［8-9］，整个提取工艺试验进行3次，试验数据取平均值。

3.1.2 石榴皮多糖质量浓度修正 由于每次取样对石榴皮多糖质量浓度进行测定时，均要取走提取液体积0.1 mL，整个试验过程要重复9次，这样会使得取样后的整个提取系统体系发生改变，因此要通过公式 （1）对石榴皮多糖质量浓度进行修正［8，10］：

Cn为第n次取样测得石榴皮多糖质量浓度的修正值，mg/mL；Ci为第n次取样石榴皮多糖的质量浓度测定值，mg/mL；VT为提取溶液体积数，（VT=50，100，150，200），ML；n为取样次数，n=1，2，…，9。

3.2 石榴皮多糖质量浓度测定方法

3.2.1 总糖质量浓度测定方法［11-12］将葡萄糖对照品于105℃干燥至恒定质量后，精密称取5 mg置于50 mL量瓶中，以水作为溶剂配制成0.1 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL分别置于25 ML具有橡胶塞的试管中，用蒸馏水将试管中溶液体积补充至2 mL，充分摇匀后，于各试管中均加入体积分数为6%重蒸苯酚试液2 mL，并迅速小心沿试管内壁滴加10 mL浓硫酸，充分震荡摇匀并静置20 min。取葡萄糖对照品加入量为0的试管内溶液作为空白对照，利用紫外-可见光分光光度计，在490 nm波长下按照浓度梯度由小到大的顺序测定吸光值。以各试管中葡糖糖系列浓度作为横坐标，以相应的吸光值作为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。得到回归方程式为：A=12.35C+0.003 8，相关系数r2=0.999 2。

3.2.2 还原糖质量浓度测定方法［13-15］精密称取3，5-二硝基水杨酸0.315 g于烧杯中，加入少量水溶解后，移入500 mL量瓶中，依次加入2 mol/L的NaOH溶液16.1 mL，含有9.25 g酒石酸钾钠水溶液200 mL，苯酚及亚硫酸钠各0.25 g，加热并充分搅拌使固体物质溶解，冷却后加蒸馏水定容至500 mL，贮存于棕色瓶中作为DNS试剂。精密量取 “3.2.1”项下对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL分别置于25 mL具塞试管中，用蒸馏水将每支试管中的溶液体积补充至2 ML，充分摇匀后，分别加入DNS试剂1.5 mL，置于水浴锅中煮沸5 min，取出放冷后，以蒸馏水为溶剂定容至25 mL，塞紧橡胶塞并摇匀。取葡萄糖对照品加入量为0的试管内溶液作为空白对照，利用紫外-可见光分光光度计，在540 nm波长下按照浓度梯度由小到大的顺序测定吸光值。以各试管中葡糖糖系列浓度作为横坐标，以相应的吸光值作为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。得到回归方程式为：A= 1.09C-0.007 5，相关系数r2=0.999 0。

3.2.3 多糖质量浓度的计算方法 样品中总糖质量浓度（CZ，mg/mL）可以通过“3.2.1”项下方法测得，样品中还原糖质量浓度（CH，mg/mL）可以通过 “3.2.2”项下方法测得，样品中多糖质量浓度 （CD，mg/mL）计算公式如下［14-15］：

3.3 石榴皮多糖提取过程动力学模型 通常情况下，从天然药物中提取有效成分的过程是相当复杂的，药材粉碎后的颗粒形态、药材质地及细胞破碎程度、溶剂穿透性能、有效成分分子质量大小等均是影响有效成分提取的主要因素。尽管影响因素多种多样，但是其本质都是溶质从物料的固相向溶剂的液相传质的过程，归纳起来，其过程一般可以分为3个步骤：第一步，提取溶剂向物料内部的渗透以及物料的润湿过程；第二步，有效成分穿破细胞壁等屏障溶解于提取溶剂中；第三步，由于物料内外存在浓度差，有效成分依靠溶剂化效应从物料内部向物料表面的扩散以及由物料表面向溶剂主体的扩散。一般认为，溶解了有效成分的溶剂在物料中由内向外扩散的过程是影响整个提取过程的关键因素，即为控制步骤。

为了便于试验研究，本实验将粉碎后的石榴皮颗粒形态简化并看作球形，同时，要求满足下列条件：A.粉碎后的干燥石榴皮粉末为均匀的球形颗粒；B.石榴皮多糖的内扩散轨迹为径向扩散；C.提取过程的任意时刻，石榴皮原料颗粒内部多糖成分分布均匀，其质量浓度以及扩散系数不发生任何变化；D.由于整个提取体系搅拌良好，温度分布均匀一致；E.石榴皮颗粒表面的传质阻力忽略不计。

本实验以Fick第二定律为理论基础，建立石榴皮多糖浸提工艺的动力学模型。前文已经假设石榴皮颗粒为球形，设定其半径为R，cm；浸入到颗粒内部的提取溶液体积为V＇，mL；颗粒外部溶液体积为V，mL；整个提取过程，t时刻颗粒内距离球心为r处的石榴皮多糖质量浓度为c，mg/mL；颗粒外主体溶剂系统中石榴皮多糖质量浓度为C，mg/mL；表面扩散系数为DS，10-6cm2/min；则Fick第二定律可以表达为［8-9］：

其边界条件是：f=0，r=0，r=R

（5）式中的S表示石榴皮颗粒与提取介质之间的接触面积，假设t=0时刻，物料内部石榴皮多糖的平均质量浓度为c0，那么初始条件为：t= 0，f=c0·r；当达到提取平衡时刻，石榴皮颗粒内外溶质的质量浓度近似相等，如果用c∞和C∞分别代表提取平衡时刻颗粒内、外石榴皮多糖的质量浓度，则有t=∞，C∞=c∞；假设颗粒外主体溶剂系统中石榴皮多糖初始质量浓度为C0，根据傅里叶变换法可以得到：

由于石榴皮多糖的质量浓度分布式为无穷级数，其高次项趋近于0，因此 （6）式中n=1，则

令k为表观速率常数，对方程式 （7）两边取对数有［9-10］：

方程式 （7）、（8）即为建立的石榴皮多糖提取动力学模型，该方程能直观反映石榴皮颗粒的半径、提取时间、提取温度以及料液比与石榴皮多糖质量浓度之间的函数关系。

4 结果与分析

4.1 石榴皮多糖提取速率常数的求解［9-10］石榴皮多糖的质量浓度在不同的提取时间、提取温度及料液比的试验条件下，实验数据如表1所示：

由表1可以看出，提取条件中，无论料液比例如何，提取系统温度越高，石榴皮多糖质量浓度达到平衡所需要的时间越短；而在相同的提取时间下，提取系统温度越高，溶液中的石榴皮多糖质量浓度越高。一般情况下，如果提取液中溶质质量浓度长时间保持恒定，就认为提取过程已经达到平衡，该时刻石榴皮多糖质量浓度即为平衡浓度（C∞）。根据表1中的数据，以ln［C∞/（C∞-C）］作为纵坐标，以 t为横坐标作图［16-17］，结果见图1和表2。

由图1和表2中的数据可以明显的看出，ln［C∞/（C∞-C）］对t的作图呈现良好的线性关系（R2＞0.95），这说明公式推导的提取动力学方程与试验的真实结果拟合度良好，石榴皮多糖的提取符合一级动力学数学模型。比较不同料液比、不同提取温度条件下速率常数k值发现，随着所设定的提取温度的提高，速率常数k值呈现逐渐增大的趋势，说明提高提取系统的温度有利于石榴皮多糖的提取［8-9］。

表1 不同提取条件下石榴皮多糖的质量浓度 （n=3）Tab.1 Mass concentration of polysaccharides froMGranati PericarpiuMunder different extraction conditions（n=3）

图1 不同提取条件下，ln［C∞/（C∞-C）］与t的关系Fig.1 Relationship between ln［C∞/（C∞-C）］and t under different extraction conditions

在不同提取温度及料液比提取条件下，石榴皮多糖相对萃余率的拟合方程同样适合指数模型，相关系数r2均大于0.95，说明指数方程式拟合精度较高。比较不同料液比、不同提取温度条件下的曲线坡度可以看出，设定的提取温度越高，石榴皮多糖质量浓度相对剩余量下降越快，到达因为提取操作前，并没有对石榴皮颗粒进行浸泡，因此C0= 0，设定石榴皮多糖相对萃余率Y=（C∞-C）/ C∞，则方程式 （7）可以转变为Y=（6/π2）exp（-kt），利用表1中的数据，以提取时间t为横坐标，以石榴皮多糖相对萃余率Y为纵坐标作图，考察趋势线拟合度［10］，以对ln［C∞/（C∞-C）］与t的线性关系进一步补充验证，结果见图2。

提取平衡所需的时间越短，同样说明提高提取系统的温度有利于石榴皮多糖的提取。通过对相对萃余率 ［（C∞-C）/C∞］与t的关系的求解，可以求算出不同料液比、不同提取温度条件下速率常数k值，这里求算k值与表2中求算的k值完全吻合，这不仅补充论证了ln［C∞/（C∞-C）］与t线性关系的真实性，也进一步证明了方程式 （7）、（8）所建立的石榴皮多糖提取动力学模型与实际测定的真实数值拟合良好，该方程能够很好的反映石榴皮颗粒的半径、提取时间、提取温度以及料液比与石榴皮多糖质量浓度之间的函数关系［18-19］。

表2 不同提取条件下，ln［C∞/（C∞-C）］与t的回归方程Tab.2 Regression equation of ln［C∞/（C∞-C）］and t under different extraction conditions

4.2 表面扩散系数 （DS）的求解［18］由方程（8）k=π2DS/R2变形得DS=k R2/π2，表2已经求算出不同料液比、不同提取温度下的速率常数k值，带入方程DS=k R2/π2（半径R2≈9×10-4cm2），求得DS值，结果见表3。

此时所得的表面扩散系数DS数值均为所设定提取温度、料液比条件下的数值，并不具备连续性和广泛应用性，鉴于此，以提取温度T为横坐标，DS数值为纵坐标作图，结果见表4，图3。

由图3、表4可以看出，石榴皮多糖表面扩散系数DS值和提取温度T的指数方程拟合度良好，线性关系r2均在0.95以上。同时可以得出：无论料液比例如何，随着系统提取温度的提高，石榴皮多糖DS值均随之增大，这是因为提取温度的升高，会使石榴皮多糖分子运动速度加快，增大了单位时间内石榴皮颗粒表面的浓度差值，使得石榴皮多糖DS值增大。

4.3 表观活化能 （Ea）的求解［19-20］通常情况下，在化学反应过程中，速率常数的数值与反应温度变化密切相关，阿伦尼乌斯公式正是描述二者关系的经验公式，公式为：k=A·exp-Ea/RT，将该公式取对数并相应转化可得：-ln k=-ln A+（Ea/RT），式中：k为速率常数，1/min；R为摩尔气体常数，数值为8.314 J/（mol·K），A为指前因子；T为提取系统温度，K；Ea为表观活化能，kJ/moL。利用表2或表3中k的数据，以-ln k为纵坐标，以1/T为横坐标作图，结果见表5，图4。

表4 石榴皮多糖DS和提取温度T的指数方程Tab.4 Exponential equation between polysaccharides froMGranati PericarpiuMDSand teMperatu re T

图3 石榴皮多糖DS和提取温度T的关系Fig.3 Relationship between polysaccharides froMGranati PoricarpiuMDSand temperature T

表5 石榴皮多糖提取-ln k和1/T的线性方程Tab.5 Linear equation between-lnk and 1/T of polysaccharides froMGranati PericarpiuMextraction

图4 石榴皮多糖提取-ln k和1/T的关系Fig.4 Relationship between-lnk and 1/T of polysaccharides froMGranati PericarpiuMextraction

由表5，图4可知，石榴皮多糖提取过程中，-ln k与1/T拟合方程线性关系良好，不同料液比条件下，相关系数r2均大于0.96，分析线性方程推算出的不同料液比条件下表观活化能Ea数值变化规律可得，料液比由1∶5→1∶20逐渐变化过程中，表观活化能Ea数值大体上呈现下降趋势。原因是根据能量守恒定律，提取条件中的溶剂量越大，使其温度升高到规定数值时所需要吸收的热量就越大，在总能量保持不变的情况下，转化为表观活化能Ea的能量就会相应减少。

4.4 半衰期 （t1/2）的求解［17］半衰期 （t1/2）为反应物质量浓度变为原来一半时的反应时间，即：C=C∞/2，C0=0，则方程（8）ln［C∞/（C∞-C）］=kt+ln［π2C∞/6（C∞-C0）］可以转化为t1/2=［ln2-ln（π2/6）］/k，表2或表3可以提供速率常数k的数据，因此t1/2数值可求得。此时所得的半衰期 （t1/2）数值均为所设定提取温度、料液比条件下的数值，并不具备连续性和广泛应用性，鉴于此，以提取温度T为横坐标，以求算的半衰期 （t1/2）数值为纵坐标作图，结果见图5，表6。

图5 石榴皮多糖提取t1/2和提取温度T的关系Fig.5 Relationship between t1/2and teMperature T for extraction of polysaccharides froMGranati Pericarpium

表6 石榴皮多糖提取t1/2和提取温度T的指数方程Tab.6 Exponential equation between t1/2and temperatures T for extraction of polysaccharides froMGranati Pericarpium

由图5、表6可以看出，石榴皮多糖提取t1/2值和提取温度T的指数方程拟合度良好，线性关系r2均大于0.95。由图5可以得出：无论料液比例如何，随着体系提取温度的提高，石榴皮多糖t1/2值均随之减小，t1/2值越小说明系统的提取效率越高，对整个工作流程越有利。这是因为随着体系提取温度的升高，会使石榴皮多糖分子运动速度加快，使得提取效率明显提高，从而有效缩短了提取时间。

5 讨论

本实验以Fick第二定律为理论基础，以石榴皮药材颗粒为原料，热水浸提为提取模式，通过对整个提取过程的浸提机制和扩散原理的深入分析，建立球形颗粒提取动力学模型，研究ln［C∞/C∞-C）］与提取时间 t之间的线性关系函数以及［（C∞-C）/C∞］与t之间的指数关系函数，通过对两种函数关系式的求解得到提取速率常数、表面扩散系数、表观活化能及半衰期等一系列动力学参数。结果表明：试验数据与动力学模式预测值吻合良好，该数学模型在一定程度上可以反映石榴皮多糖质量浓度与石榴皮颗粒半径、料液比、提取时间和提取温度等工艺参数之间的函数关系。

研究结果还证实了石榴皮多糖提取是一个复杂的固液相转移过程，由于中药材自身组织结构的差异性、所含功能成分的多样性及浸提过程的复杂性等诸多因素，建立一个普遍应用的提取工艺动力学模型是十分困难的。当前及今后针对这一研究领域的重点应该放在：如何根据中药材物料的不同，建立更加合适的动力学模型；如何通过有效的改进模型可靠性验证方法及相关联参数的确定方法，以提高提取动力学模型在实际生产工艺中的广泛应用性和预测的精确性。

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DynaMics analysis of the extraction of polysaccharides froMGranati Pericarpium

WANG Zhan-yi1， DAIBo2， WANG Yu-hai1， ZHANG Li-hua1， LIZhuo-wa1， BIHai-dan1
（1.College of Life Science，Zaozhuang University，Zaozhuang 277160，China；2.Department of Pharmacy，Air Force General Hospital，People's Liberation Army，Beijing 100142，China）

AIMTo obtain the parameters for hotwater extraction of polysaccharides froMGranati PericarpiuMbased on dynamic mathematicalmodel.METHODSPolysaccharides were extracted thermostaticlly in different temperatures after Granati PericarpiuMbeing defatted by petroleuMether.With the total sugar and reducing sugar as indice，extraction parameters，such as kinetic rate constant k，the relative rates of raffinate，surface diffusion coefficient DS，the apparentactivation energy Ea，half-life values t1/2，were thus obtained.RESULTSThe dynamic extraction process fitted the first order reaction equation.The higher the temperature for extraction，the shorter time for polysaccharides froMGranati PericarpiuMconcentration to reach the required balanced state，k values and DSvalues intended to increase gradually，butwith a relative rapid decline of raffinate，and both Eavalues and t1/2values generally presented to decrease.CONCLUSIONThe extraction kinetics parameters for polysaccharides froMGranati PericarpiuMsuggest that the critical proceduremay lie in the inner diffusion of the solvent duringmaceration.

Granati Pericarpium；polysaccharide；extraction；dynamics analysis

R969.1

：A

：1001-1528（2015）05-0971-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.010

2014-09-09

国家星火计划项目 （2012GA740049）；山东省自然科学基金 （ZR2013BL018）

王占一 （1980—），男，硕士，讲师，执业药师，从事天然药物有效成分提取分离工作。Tel：（0632）3785886，E-mail：zhyiwang@126.com