陆庭嫣，沈俐，唐振华

(上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院，上海200030)

不同培养基及B族链球菌增菌肉汤检测B族链球菌效果评价

陆庭嫣，沈俐，唐振华

(上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院，上海200030)

目的通过分析B族链球菌(GBS)检测的阳性检出率和平板选择性能来评价GBS筛查培养基、哥伦比亚血琼脂培养基和GBS增菌肉汤检测结果的可靠性和临床应用的可行性。方法收集妊娠晚期35～37周孕妇阴道下端及肛周样本242例、中段尿样本15例，同时直接接种及经GBS增菌肉汤增菌后接种哥伦比亚血平板和GBS筛查平板，观察各培养基上GBS的生长情况。结果直接接种后分别培养24 h和48 h，哥伦比亚血琼脂培养基GBS的检出率均为7.39%(19/257);而GBS筛查培养基的检出率为24 h 5.45%(14/257)、48 h 7.39% (19/257)。经GBS增菌肉汤增菌后，无论培养时间是24 h还是48 h，哥伦比亚血琼脂培养基GBS的检出率均为9.73%(25/257);GBS筛查培养基的检出率均为8.95%(23/257)。与直接接种相比，选择性增菌后GBS的检出率明显升高;2种培养基GBS的检出率差异无统计学意义(P＞0.05)。结论临床样本先经GBS增菌肉汤18～24 h增菌后再接种至GBS筛查培养基或哥伦比亚血琼脂培养基，24 h即可观察生长结果，GBS菌落易于辨认且提高了阳性检出率。

B族链球菌;B族链球菌筛查培养基;哥伦比亚血琼脂培养基;B族链球菌增菌肉汤;阳性检出率

B群链球菌(Group B Streptococcus，GBS)又称无乳链球菌(Steptococcus agalactiae)，是一种条件致病菌，是新生儿和孕妇围产期感染的重要病原菌，可造成孕妇菌血症、无症状菌尿症、羊膜炎和伤口感染等，造成新生儿败血症、肺炎和脑膜炎等［1-3］。新生儿早发型GBS感染主要与母体垂直传播有关，母亲孕期泌尿生殖道或胃肠道的GBS定植是新生儿早发型GBS感染的主要危险因素［4-6］。因此，临床实验室有必要加强对晚期妊娠孕妇的GBS筛查。研究显示［7］欧洲孕期妇女阴道及直肠GBS的定植率为6.5%～36.0%，在非洲坦桑尼亚妇女阴道及直肠GBS的定植率为23%。我国文献报道［5，8-9］母体GBS带菌率为3.4%～15.8%，定植率的不同可能与国家地区、种族基因、年龄、教育程度、培养技术及培养频率不同有关。我们比较了GBS增菌肉汤增菌前、后哥伦比亚血平板和GBS筛查平板的GBS检出率。

材料和方法

一、菌株

1.临床菌株盲选收集上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院2013年4月至7月的妊娠晚期(35～37周)孕妇阴道下端及肛周样本242例、中段尿样本15例。

2.质控菌株无乳链球菌ATCC 12386、大肠埃希菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、白念珠菌ATCC 10231。

二、仪器与试剂

VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统(简称VITEK 2 Compact)及其配套革兰阳性细菌鉴定卡(法国生物梅里埃公司)，哥伦比亚血琼脂培养基、GBS增菌肉汤、GBS筛查培养基购自梅里埃(上海)生物制品有限公司。革兰染色试剂和触酶试剂购自珠海贝索公司。

三、方法

1.采样35～37周妊娠晚期孕妇阴道下端及肛周样本无菌棉签采集后洗脱在1.5 mL无菌生理盐水中。

2.直接接种分别吸取50 μL样品，直接涂布在GBS筛查培养基和哥伦比亚血琼脂培养基上，35℃、5%CO2条件下孵育。

3.增菌后接种吸取50 μL样品，于GBS增菌肉汤中增菌，35℃、5%CO2条件下培养18～24 h后用无菌棉签涂布于GBS筛查培养基、哥伦比亚血琼脂培养基上，将培养基倒置，于35℃、5%CO2条件下进行孵育。

四、结果判读和鉴定

1.GBS筛查培养基在35℃、5%CO2条件下避光孵育18～24 h，若观察到粉色至红色典型菌落，挑取典型菌落采用VITEK 2 Compact进一步鉴定确认，记录结果;若没有观察到典型菌落将孵育时间延长到48 h，挑取典型菌落采用VITEK 2 Compact进一步鉴定并记录结果。

2.哥伦比亚血琼脂培养基在35℃、5% CO2条件下孵育18～24 h，对可疑的菌落(中小灰白，有β溶血)用革兰染色和触酶试验筛选，对革兰阳性球菌和触酶阴性的可疑菌落用VITEK 2 Compact进一步确认，若没有观察到可疑菌落将孵育时间延长到48 h。

3.GBS筛查培养基的选择性能对接种到GBS筛查培养基上的非目标菌群生长密度进行了记录(培养时间相同)，记录方法如下:以生长密度计，0为无生长、1为一区生长(或1～9个菌落)、2为二区生长(或10～99个菌落)、3为三区生长(或100～999个菌落)、4为四区生长(或1 000个以上的菌落)。

五、质控

所有培养基均采用相应菌株做质控，见表1。

表1 培养基质控表

六、统计学方法

采用Stata 11.0软件进行统计分析。两种培养基的阳性检出率比较采用配对卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、2种培养基直接接种的阳性检出率比较

直接接种后哥伦比亚血琼脂培养基培养24和48 h的GBS检出率均为7.39%(19/257);GBS筛查培养基培养24 h的GBS检出率为5.45% (14/257)，培养48 h为7.39(19/257)。2种培养基的阳性检出率差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 2种培养基直接接种的检测结果

二、增菌后接种2种培养基阳性检出率的差异经GBS增菌肉汤增菌后，无论培养24 h还是48 h，哥伦比亚血琼脂培养基GBS的检出率为9.73%(25/257);GBS筛查培养基的检出率为8.95%(23/257)。2种培养基的阳性检出率差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。与直接接种比较，增菌后再培养的GBS检出率明显提高。

表3 经GBS增菌肉汤增菌后2种培养基的培养结果

三、GBS筛查培养基选择性能

在GBS筛查培养基上非目标菌群(大多为肠球菌、酵母样真菌、其他链球菌)集中表现为蓝色、蓝-灰、蓝-紫和淡绿色等菌落。这些菌落在培养24 h时大多被抑制或生长细小，培养48 h会有部分生长，但与目标菌GBS的中等大小浅红至红的典型菌落区分明显。有部分非典型小红色菌落鉴定为草绿色链球菌(样本编号为80、85、217、231、779、915)或粪肠球菌(样本编号493)。见表4。

表4 GBS筛查培养基的选择性能

讨论

GBS的检测方法多样，最常见的培养法、抗原检测法及聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)法各有优缺点。培养法直观、准确，但培养周期长;抗原检测法快速，但假阴性不易排除;PCR法快速、敏感，但假阳性不易排除。对于危急患者建议选择PCR法，但对于一般的孕妇妊娠晚期筛查还是培养法较为经典，可以在特定的阶段用药预防感染［8，10-11］。

本研究结果显示直接接种哥伦比亚血琼脂培养基培养24和48 h的GBS检出率均为7.39%，这与我院历年孕前GBS筛查5%～7%的阳性率基本相符;GBS筛查培养基检出率培养24 h为5.45%、培养48 h为7.39%，提示临床样本直接接种GBS筛查培养基时不能只观察24 h的结果，须延长培养时间至48 h才能减少漏检的可能。通过GBS增菌肉汤增菌18～24 h后，无论培养24 h还是48 h，哥伦比亚血琼脂培养基GBS检出率均为9.73%，GBS筛查培养基检出率均为8.95%。与直接接种比较，增菌后再培养的GBS检出率明显提高。增菌后的GBS生长观察时间可以缩短至24 h。分析GBS筛查培养基GBS检出率略低于哥伦比亚血琼脂培养基的原因可能是选择性筛查培养基因含有混合抗生素，可抑制杂菌的生长，但也可能会同时轻度抑制GBS的生长或影响培养基最低检出量的敏感性。当然，这还需要更大样本量的检测分析及培养基灵敏度实验的进一步证实。

从培养基的选择性能来看，因阴道或肛周菌群较多，所以样本直接接种哥伦比亚血琼脂培养基时GBS生长受其它细菌影响较大，辨认时需要工作人员有一定的经验，但经GBS增菌肉汤增菌后培养基上的非目标菌受抑制，GBS增量且易于辨认。GBS筛查培养基上的GBS目标菌为中等大小浅粉至红色的菌落，大多数的非目标菌群得到很好的抑制，表现为蓝色、蓝-灰、蓝-紫和淡绿色等菌落，易于辨认。

本研究中不容忽视的是GBS增菌肉汤的作用。增菌肉汤含有抗菌药物(萘啶酸和黏菌素)能抑制样本中大部分革兰阴性菌的生长，并且其中有助于链球菌生长的营养成分弥补了GBS可能被轻度抑制的缺陷。与直接接种比较，增菌后再培养的GBS检出率明显提高。甚至可将GBS增菌肉汤增菌这一步的检验步骤提前，将其作为GBS单项检测的一种运送培养基，临床医生取完样本后直接就可以置入增菌肉汤中等待送检，这样也避免了常规样本取材后因不能立即送检，导致拭子干燥，致使GBS出现部分死亡。

综上所述，本研究结果显示对孕妇晚期妊娠的GBS筛查培养的理想模式为临床样本先经GBS增菌肉汤18～24 h增菌后再接种至哥伦比亚血琼脂培养基或GBS筛查培养基，24 h即可观察培养结果。GBS增菌肉汤减小了接种哥伦比亚血琼脂培养基时杂菌对GBS生长的影响，也弥补了单纯接种GBS筛查培养基敏感性较低，易导致漏检的缺点，从而发挥出GBS筛查培养基目标菌识别快速、简单的优势，保证了GBS阳性检出率的提高。

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Evaluation on the efficiency of different med ia and GBS enrichment broth for GBS detection

LU Tingyan，SHEN Li，TANG Zhenhua.(The International Peace Maternity and Child Health Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200030，China)

ObjectiveTo evaluate the reliability of Group B Streptococcus(GBS)screening medium，Colombia blood agar medium and GBS enrichment broth detection results and investigate the viability of clinical application by analyzing the positive rate of GBS and the performance of selective plates.MethodsA total of 242 samples from distal vaginal segment and around crissum and 15 m idstream urine samples were collected among 35-37-week pregnant women.The samples were inoculated directly and with one more step of GBS enrichment broth on Colombia blood agar and GBS screening media，respectively，and the growth of GBS in the 2 kinds of media was observed.ResultsAs for inoculating directly，the detection rates of GBS in Colombia blood agar medium for 24 h and 48 h were 7.39%(19/257)，and the 24 h and 48 h detection rates of GBS in GBS screening medium were 5.45%(14/257)and 7.39%(19/257)，respectively.As for inoculating with one more step of GBS enrichment broth，for neither 24 h nor 48 h，the detection rate of GBS in Colombia blood agar medium was 9.73%(25/257)，and the detection rate in GBS screening medium was 8.95%(23/257)，both of which had an evident increasing comparing with the former one.There was no statistical significance for the detection rate between the 2 kinds of media(P＞0.05).ConclusionsBy enriching 18 h-24 h in GBS enrichment broth，followed by inoculating in GBS screening medium or Colombia blood agar medium，the growth of GBS from clinical samples in media could be observed just after 24 h，and this method has simple recognition ability for GBS and can improve GBS positive detection rate.

Group B Streptococcus;Group B Streptococcus screening medium;Colombia blood agar medium; Group B Streptococcus enrichment broth;Positive detection rate

1673-8640(2015)09-0890-04

R378.1

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.006

2014-12-19)

(本文编辑:龚晓霖)

陆庭嫣，女，1973年生，主管技师，主要从事临床微生物检验工作。

唐振华，联系电话:021-64070434-28801。