郑秀峰，赵石磊，杨力明

1.黑龙江省医院心内科，黑龙江哈尔滨 150036；2.哈尔滨医科大学第一附属医院肾病内科，黑龙江哈尔滨 150001；3.哈尔滨医科大学病理生理教研室，黑龙江哈尔滨 150001

冠状动脉内干细胞灌注对载脂蛋白E基因缺陷小鼠离体心脏血液动力学影响的实验研究

郑秀峰1，赵石磊2，杨力明3

1.黑龙江省医院心内科，黑龙江哈尔滨 150036；2.哈尔滨医科大学第一附属医院肾病内科，黑龙江哈尔滨 150001；3.哈尔滨医科大学病理生理教研室，黑龙江哈尔滨 150001

目的探讨冠状动脉内干细胞灌注对载脂蛋白E基因缺陷小鼠离体心脏血液动力学的影响。方法设计Langendorff离体心脏灌注模型，比较接受低剂量（1.0×106）、高剂量（2.5×106）干细胞灌注时及灌注后5min、15min、30min两组载脂蛋白E基因缺陷小鼠（低剂量组、高剂量组）和两组WT小鼠心脏（低剂量对照组、高剂量对照组）的血流动力学指标。同时比较注射后5min、15min、30min时，两组心脏细胞的血流动力学指标。结果四组T1~T4时刻的心率均显著低于T0时刻差异有统计学意义（P<0.05）；且高剂量组的心率变化最明显。四组在进行细胞灌注后，LVEDP水平均显著升高，+dp/dt和-dp/dt水平均显著降低，且均以高剂量组的上升或下降幅度最为显著。细胞灌注后，四组的冠脉流量均较灌注前显著降低差异有统计学意义（P<0.05）；且以高剂量组的降低幅度最明显，与其他三组比较差异有统计学意义（P<0.05）。灌注后30min，四组的漏出液细胞含量均达到了60%以上。结论冠脉内干细胞灌注会对载脂蛋白E基因缺陷小鼠离体心脏的血流动力学产生不良影响，并且灌注剂量越大，不良影响越显著。

血流动力学；载脂蛋白E基因缺陷；干细胞灌注；冠状动脉

近年来，干细胞移植成为了国内外临床治疗缺血性心脏病的热点研究课题。冠状动脉内干细胞灌注具有操作简单，能在进行冠脉血运重建时实施等优点，受到了相关领域的广泛关注[1]。然而，冠脉内干细胞注射是否会对受体心功能产生影响，以及最后留存于心脏中的细胞数量多少等问题都还未明确[2]。为明确冠状动脉内干细胞灌注对缺血性心脏病心脏血液动力学的影响，该研究在2014年1月—2014年6月间对脂蛋白E（apo E）基因缺陷小鼠进行了实验研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

实验起止时间：2014年1月—2014年6月。实验动物：20只apo E小鼠、20只WT小鼠，雌雄各半。所有小鼠均经腹腔注射60mg/kg苯巴比妥钠，麻醉后将小鼠心脏取出，放入10 U/ML的肝素冰水灌注液中，并将主动脉与灌注管相连接。灌注细胞：小鼠胚胎干细胞，在未分化状态下，进行细胞灌注前2 d，开始经贴壁培养，并在灌注当天消化获取。细胞活力经鉴定＞99.5%，之后配成1.0×106细胞/5mL和2.5×106细胞/5mL的灌注液。灌注液：NaCl（120mmol/L）+NaHCO3（25 mmol/L）+KCl（4.7 mmol/L）+CaCl2（2.5 mmol/L）+ Mg2SO4（1.2 mmol/L）+KH2PO4（1.2 mmol/L）+葡萄糖（15 mmol/L）+ EDTA（0.5mmol/L）+Pyruvate（2mmol/L）。灌注液酸碱度7.4，温度37℃，同时补充5%的二氧化碳和95%的氧气。

1.2 方法

分别取10只apo E小鼠的心脏作为低剂量组和高剂量组，低剂量组的干细胞灌注量为1.0×106细胞，高剂量组的干细胞灌注量为2.5×106细胞。另外分别取10只WT小鼠的心脏分别作为低剂量对照组和高剂量对照组，低剂量对照组的干细胞灌注量为1.0×106细胞，高剂量对照组的干细胞灌注量为2.5×106细胞。将左心房切开，置入测压球囊达到二尖瓣口水平，并将基础压力调整至10mmHg，然后开始进行细胞灌注。排除5min内出现冠脉血流大于5mL/min者，收缩压低于100mmHg者，心率低于320次/min及严重心律失常者。

1.3 观察指标

比较离体心脏各时刻（T0：5 min稳定后；T1：灌注完成即刻；T2：灌注后5min；T3：灌注后15min；T4：灌注后30 min）的血流动力学指标：LVPP（左心室最大压力）、心率、+dp/dt（左心室等容收缩期压力最大变化速率）、-dp/dt（左心室等容舒张期压力最大变化速率）、LVEDP（左心室舒张末压）。并观察各组的冠脉流量、漏出液中的细胞含量。5min稳定后。

1.4 统计方法

该次研究数据采用SPSS 19.0统计学软件进行处理，计数资料以率%表示，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，数据比较分别采用χ2检验和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心率变化

各组的心率变化比较见表1。从表1可知，四组T1~T4时刻的心率均显著低于T0时刻差异有统计学意义（P<0.05）；且高剂量组的心率变化最明显，低剂量组其次，高剂量对照组第三，低剂量对照组的心率变化最小。

2.2 LVEDP变化

四组的LVEDP变化见图1。从图1可知，四组在进行细胞灌注后，LVEDP水平均显著升高，且以高剂量组的上升幅度最为显著。

图1 四组的LVEDP变化

2.3 +dp/dt和-dp/dt变化

四组的+dp/dt和-dp/dt变化分别见图2和图3。从图2、3可知，细胞灌注后，四组的+dp/dt和-dp/dt水平均显著降低，且以高剂量组的下降幅度最为明显。

2.4 冠脉流量、漏出液细胞含量

细胞灌注后，四组的冠脉流量均较灌注前显著降低差异有统计学意义（P<0.05）；且以高剂量组的降低幅度最明显，与其他三组比较差异有统计学意义（P<0.05）。灌注后30 min，四组的漏出液细胞含量均达到了60%以上。见表2。

图2 四组的+dp/dt变化

图3 四组的-dp/dt水平变化

表2 四组灌注前后的冠脉流量及漏出液细胞含量比较（x±s）

3 讨论

目前，初期临床研究和动物实验均证实了细胞替代治疗心血管疾病尤其是缺血性心力衰竭的安全性和可行性[3]。分析近期大量研究报道发现，关于成体干细胞治疗心血管疾病的近30项研究中，仅有4项研究得出的结论有益于该治疗方法，关于移植急性期对心脏血流动力学的影响，以及细胞移植确切疗效等问题的研究仍未得到有效解决[4]。

在该次研究中，针对心血管疾病的冠脉干细胞移植疗法，利用Langendorff体外灌注模型，模拟了冠脉干细胞移植治疗方法，用以观察其对心脏血流动力学指标的影响。该次实验结果显示：四组T1~T4时刻的心率均显著低于T0时刻差异有统计学意义（P<0.05），且高剂量组的心率变化最明显从T0时刻的 （347.6± 29.7）次/min降至T4时刻的（245.4±40.9）次/min；并且四组在进行细胞灌注后，LVEDP水平均显著升高，+dp/dt和-dp/dt水平均显著降低，且均以高剂量组的上升或下降幅度最为显著。这提示冠脉干细胞灌注会对LVPP、心率、+dp/dt、-dp/dt、冠脉流量、LVEDP等心脏血流动力学指标产生不利影响，且灌注剂量越高，影响越明显。

apo E缺陷小鼠会因胆固醇代谢障碍而发生高胆固醇血症，同时还会发生全身动脉血管粥样硬化。而临床研究已证实冠心病心肌梗死的基础病因就是冠状动脉粥样硬化，冠心病心肌梗死患者的病理变化与apo E缺陷小鼠冠脉病理变化类似，故该次实验结果能够为临床研究冠脉内干细胞灌注治疗冠心病心肌梗死提供一定的参考、借鉴。一直以来，冠脉细胞移植灌注可能引起冠脉微循环栓塞都是临床应用冠脉内干细胞灌注治疗冠心病的一大顾虑。国外有动物实验研究[5]显示，冠脉抑制自体骨髓MSC（间充质干细胞）会引起冠脉微循环栓塞。在该次研究中，结果也显示干细胞灌注后，冠脉血流量明显降低，尤其是高剂量组小鼠的冠脉血流量降低更为显著。推测这可能是因为冠脉微循环受累所致。干细胞移植的细胞大小、细胞类型都会对冠脉微循环栓塞的形成产生不同的影响。国外有实验研究应用了培养后的字体骨髓MSC，结果发现此类细胞存在较为明显的安全性问题[6]。在该次研究中，应用了胚胎干细胞，该细胞的体积类似于未培养的骨髓单核细胞，虽然尚无文献报道未培养骨髓干细胞会引起微循环栓塞，但不少临床研究都未连续监测细胞移植后的心肌酶谱变化，故冠脉细胞移植是否会对冠脉微循环产生影响仍有待进一步考证。

综上所述，冠脉内干细胞灌注会对载脂蛋白E基因缺陷小鼠离体心脏的血流动力学产生不良影响，并且灌注剂量越大，不良影响越显著。

[1]罗罕,李安杰,周永刚，等.超选择性冠状动脉内脐血干细胞移植治疗冠心病的初步研究[J].贵州医药,2013,37(3):206-208.

[2]王世宏,崔俊玉,路敏，等.冠状动脉自体骨髓CD34+干细胞移植治疗心绞痛:随机对照临床分析[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13 (14):2623-2626.

[3]尹作民,李长江,王燕，等.冠状动脉内注射自体骨髓干细胞改善急性心肌梗死患者的心功能[J].中国医药,2010,5(9):785-787.

[4]韦艳.干细胞修复缺血性心肌损伤研究进展[J].海南医学,2012,23(8): 119-122.

[5]肖文涛,高丽君,高传玉，等.不同类型骨髓干细胞移植治疗扩张型心肌病的疗效对比[J].中华心血管病杂志,2012,40(7):575-578.

[6]肖文涛,高传玉,戴国友，等.自体骨髓间充质干细胞移植修复无功能心肌的对比[J].中国组织工程研究,2012,16(27):5081-5086.

Experimental Study of the Effect of Intracoronary SteMCell Infusion on the Isolated Heart HeModynaMics in Mice with Apolipoprotein E Gene Defect

ZHENG Xiu-feng1，ZHAO Shi-lei2，YANG Li-Ming3
1.Cardiovascular Department,Heilongjiang Provincial Hospital,Harbin,Heilongjiang Province,150036 China;2.Nephrology Department,The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin,Heilongjiang Province 150001,China;3.Department of Pathophysiology,Harbin Medical University,Harbin,Heilongjiang Province,150001 China

Ob jectiveTo investigate the effectof intracoronary steMcell infusion on the isolated hearthemodynamics inmice with apolipoprotein E gene defect.MethodsLangendorff isolated heart perfusion model was set up.The mice with apolipoprotein E gene defectwere equally divided into low-dose group [steMcells perfusion (1.0×106)]and high-dose group[steMcells perfusion (2.5×106)],and the same amount ofWTmice were equally divided into low-dose control group[steMcells perfusion(1.0×106)]and high-dose control group[steMcells perfusion(2.5×106)].The heart hemodynamics was compared between the groups at the time of perfusion,5Min,15min,and 30Min after perfusion.And the heart cells hemodynamics were compared between the groups 5min, 15min,and 30min after injection.Resu ltsThe heart rate of the four groups wasmuch lower at T1~T4 than at T0(P<0.05);and the heart rate of high-dose group changed most significantly.After perfusion of steMcells,the levels of LVEDP increased obviously while levels of+dp/dt and-dp/dt decreased significantly in the four groups,and the high-dose group had the biggest increase or decline.Compared with before perfusion of steMcells,after perfusion,the coronary blood flow in the four groups decreased significantly,P<0.05,and the high-dose group had the biggest decline compared with the other three groups(P<0.05).30min after perfusion,the proportion of cells in transudate reached more than 60%in all the four groups.ConclusionThe intracoronary infusion of steMcells adversely affected the heart hemodynamics in mice with apolipoprotein E gene defect,and the greater the infusion dose was,themore significant adverse effectswere.

Hemodynamics;Apolipoprotein E gene defect;SteMcell infusion;Coronary artery

R687.3

A

1674-0742（2015）06（b）－0006-03

2015-03-18）

郑秀峰（1982-），男，黑龙江哈尔滨人，硕士在读，主治医师，主要从事心血管病方面的工作。

杨力明（1978-），男，黑龙江五常人，博士后，哈尔滨医科大学病理生理教研室。