吴 勰 王葆青 张 进 姜 楠王慧君 马 端，△

（1复旦大学基础医学院代谢与分子医学教育部重点实验室 上海 200032，2复旦大学附属中山医院呼吸科 上海 200032，3复旦大学附属儿科医院儿童发育与疾病转化医学研究中心 上海 201102）

简讯

Ⅱ型肺泡细胞Tfpi-1基因敲除对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的影响

吴 勰1王葆青2张 进1姜 楠1王慧君3马 端1，3△

（1复旦大学基础医学院代谢与分子医学教育部重点实验室 上海 200032，2复旦大学附属中山医院呼吸科 上海 200032，3复旦大学附属儿科医院儿童发育与疾病转化医学研究中心 上海 201102）

目的 观察Ⅱ型肺泡细胞组织因子途径抑制物1（tissue factor pathway inhibitor 1，TFPI-1）基因敲除对细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠急性肺损伤（acute lung injury，ALI）的影响。方法将Tfpi-1flox/flox转基因小鼠和表面活性蛋白A（surfactant-associated protein A，Spa）-环化重组酶（cyclization recombination enzyme，Cre）转基因小鼠交配，获得Tfpi-1flox/flox：Spa-Cre基因型小鼠（C57BL/6J），使用免疫组化和荧光定量PCR检测不同基因型小鼠肺组织中TFPI-1的表达差异。LPS诱导ALI 24 h后运用体积描记法和有创呼吸功能检测法检测小鼠的呼吸功能；通过肺泡灌洗，计数肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中白细胞的数目；BCA法测定BALF中总蛋白水平；ELISA测定BALF中纤溶酶原激活物抑制因子1 （plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1）的浓度，HE染色观察肺损伤的程度；计算肺湿/干重比（wet/dry weight ratio，W/D）。结果未干预情况下，Tfpi-1flox/flox：Spa-Cre基因型小鼠相对于野生型小鼠肺部结构和呼吸功能无明显变化。LPS诱导后，Tfpi-1flox/flox：Spa-Cre基因型小鼠相对于野生型小鼠肺损伤分数、BALF中白细胞总数、W/D和BALF中PAI-1浓度显著升高，潮气量（tidal volume，TV）、每分通气量（minute ventilation，MV）、吸气时间（inspiratory time，Ti）、肺动态顺应性（dynamic lung compliance，C）有降低趋势，而呼气时间（expiratory time，Te）、气道阻力（airway resistance，R）有升高趋势。结论Ⅱ型肺泡细胞条件性敲除Tfpi-1基因促进了LPS诱导的小鼠ALI，影响了小鼠的呼吸功能。

基因敲除； 脂多糖； 急性肺损伤； 峰值呼气流速； 组织因子途径抑制物； Ⅱ型肺泡细胞；小鼠

【Abstraet】 Objcetivc To investigate the effect of conditional knockout of tissue factor pathway inhibitor 1（TFPI-1）gene in typeⅡpneumocytes on lipopolysaccharide（LPS）-induced acute lung injury（ALI）in mice. Mcthods Tfpi-1flox/floxtransgenic mice and surfatcant-associated protein A（Spa）-cyclization recombination enzyme（Cre）transgenic mice were inbreeded to produce Tfpi-1flox/flox：Spa-Cre mice.The expression of Tfpi-1 from the lung of mice was detected by immunohistochemistry and realtime PCR method.LPS was used to induce ALI.At 24 hours after LPS exposure，respiratory function was measured by plethysmography and invasive respiratory function test.Then the mice were euthanized to obtain bronchoalveolar lavage fluid（BALF），and the number of leukocyte were counted.The levels of protein concentration in BALF were measured by BCA methods，and the concentration of plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1）was measured by ELISA.Lung injury was observed by HE staining，and wet/dry weight ratio（W/D）were measured. Rcsults Solo Tfpi-1 knockout in typeⅡpneumocytes did not affect the lung structure and respiratory function in Tfpi-1flox/flox：Spa-Cre mice compared with wild-type mice.After induced by LPS，lung injury score，total number of leukocytes，W/D and the concentration of PAI-1 in BALF were significantly elevated.The respiratory function such as tidal volume（TV），minute ventilation（MV），inspiratory time（Ti），and dynamic lung compliance（C）were slightly decreased in Tfpi-1flox/flox：Spa-Cre mice，while expiratory time（Te）and airway resistance（R）were slightly increased compared with wild-type mice. Conelusions Conditional Tfpi-1 knockout in typeⅡpneumocytes promotes the progress of ALI induced by LPS and affects the respiratory function in mice.

【Kcy words】 gene knockout； lipopolysaccharide； acute lung injury； peak expiratory flow；tissue factor pathway inhibitor； typeⅡpneumocytes； mouse

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是由严重感染、创伤、休克、中毒、吸入有害气体、急性胰腺炎、病理产科等导致的急性、进行性呼吸衰竭，以肺毛细血管通透性增强、透明膜的形成、肺不张、进行性的呼吸窘迫为主要特征。该过程中肺泡内外源性凝血途径被激活，伴随着抗凝物质减少和纤溶抑制，造成肺泡内凝血-抗凝-纤溶异常，使肺泡内处于一种高凝状态［1］。组织因子途径抑制物1（tissue factor pathway inhibitor 1，TFPI-1）是一种主要由血管内皮分泌的内源性组织因子（tissue factor，TF）抑制物，是人体内最主要的生理性抗凝物质。有文献报导通过TF启动的外源性凝血途径主要由TF与TFPI-1之间的平衡来调节［2］。肺组织的血管内皮细胞、肺泡细胞和巨噬细胞都能表达TFPI-1［3］，不同来源的TFPI-1在ALI中的作用尚不清楚。由于肺内多种细胞可表达TFPI-1，单独Ⅱ型上皮细胞敲除限于表达量以及其他细胞代偿的情况不一定能引起显著的变化。本研究首次通过在小鼠Ⅱ型肺泡细胞中条件性敲除Tfpi-1基因并建立小鼠ALI模型，来评价Ⅱ型肺泡细胞缺失Tfpi-1基因后，小鼠ALI时肺组织结构和功能的变化，以评价Tfpi-1基因对ALI的影响。

材料和方法

实验动物Ⅱ型肺泡细胞特异表达Cre的杂合子小鼠（Spa-Cre）由北京军事医学科学院杨晓教授惠赠。该小鼠和指示小鼠（ROSA26转基因小鼠）交配，LacZ染色显示Spa-Cre：ROS A26双转基因小鼠的Ⅱ型肺泡细胞具有较强β-半乳糖苷酶活性而呈蓝染，说明表达Cre的Ⅱ型肺泡细胞具有组织特异性［4］。Tfpi-1flox/flox转基因小鼠由本课题组和上海南方模式动物中心共同制作：通过同源重组的方法在Tfpi-1基因的第3内含子中插入1段序列，该序列含有1个基因失活（gene inactivation，GI）元件，其两端标记有Loxp序列，其余部分包含neo筛选基因序列。通过构建Tfpi-1干细胞打靶载体、电转SCR012小鼠胚胎干细胞、正负药物筛选、PCR鉴定和测序鉴定，筛选出两侧臂均为阳性的胚胎干细胞克隆。通过对阳性胚胎干细胞克隆进行囊胚显微注射、胚胎移植等得到Tfpi-1flox/flox转基因小鼠。将Tfpi-1flox/flox小鼠和Spa-Cre转基因小鼠杂交后，获得Tfpi-1flox/flox：Spa-Cre基因型小鼠（C57BL/6J），Cre倒转GI元件，倒转后的GI元件通过使Tfpi-1基因转录终止和在转录后水平破坏基因的正常剪接这两种方式来实现基因的敲除。Cre在Spa启动子的作用下，在Ⅱ型肺泡细胞中特异表达，从而达到条件性敲除Tfpi-1的目的。

动物分组将18只KO小鼠（C57BL/6J；雌性15只，雄性3只）分为敲除对照组（9只雌性）和敲除LPS组（6只雌性，3只雄性），将18只同窝Tfpi-1flox/+或Tfpi-1flox/flox基因型小鼠（C57BL/6J；雌性15只，雄性3只）分为野生型对照组（9只雌性）和野生型LPS组（6只雌性，3只雄性）。小鼠体质量18 ～22 g（清洁级），饲养于复旦大学基础医学院生物化学与分子生物学系动物房，标准饲料喂养，自由进食和饮水，普通光照。先检测对照组小鼠呼吸功能，之后取3只小鼠进行肺组织TFPI-1表达分析，另取3只小鼠进行肺组织TFPI-1荧光定量PCR检测，其余进行肺组织病理学检查，LPS组小鼠气管滴注LPS（5 mg/kg）制备ALI模型［5］。雌性小鼠于模型制备完成24 h后进行呼吸功能检测，取其中3只雌性小鼠进行肺组织病理学检查，另外3只雌性小鼠进行肺组织肺泡灌洗，其余3只雄性小鼠进行肺组织湿/干重比（wet/dry weight ratio，W/D）测定。动物实验的过程符合复旦大学《实验动物管理条例》的要求。

主要试剂鼠尾基因组抽提试剂盒购自美国Axygen公司，PCRMix购自上海莱枫生物科技有限公司，TFPI-1抗体购自美国Santa Cruz公司，即用型SABC-POD兔（IgG）试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，DAB显色试剂盒和Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，焦碳酸二乙酯（Diethypyrocarbonate，DEPC）购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司，实时定量PCR试剂盒购自日本Takara公司，PCR引物由上海博尚生物技术有限公司和上海桑尼生物科技有限公司合成，红细胞裂解液购自美国Sigama公司，BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所，小鼠PAI-1 ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，异丙醇、氯仿、无水乙醇购自上海国药集团。常用化学试剂水合氯醛、戊巴比妥钠、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4等均为进口分装或国产分析纯。

基因型鉴定剪小鼠尾，按照Axygen组织基因组DNA提取试剂盒说明操作，提取小鼠基因组DNA。利用特定序列引物，采用PCR方法对小鼠基因型进行鉴定，基因型为Tfpi-1+/+小鼠（野生型）可见600 bp条带，Tfpi-1flox/flox小鼠可见500 bp条带，杂合子基因型为Tfpi-1flox/+则可见500和 600 bp条带。表达Cre的小鼠PCR产物电泳可见724 bp条带，不表达Cre的小鼠无此条带。

rcal-timc PCR检测将肺组织放入预冷的匀浆器中，用trizol试剂提取总RNA，逆转录后进行荧光定量PCR反应。TFPI-1引物序列：上游，5＇-TCTGTTGCTTAGCCTTGTTCCCGA-3＇；下游，5＇-TGCTTTGCATGGACCATCATCTGC-3＇；GAPDH引物序列：上游，5＇-TGTCGTGGAGTCTACTGGTGTCTT-3＇，下游，5＇-TTCTCGTGGTTCACACCCATCACA-3＇。real-time PCR检测以GAPDH为内参，RQ值的计算采用2-ΔΔCT的方法。

TFPI-1免疫组织化学TFPI-1单克隆抗体以1∶50稀释，肺组织石蜡切片，采用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶（ABC）法检测肺组织TFPI-1表达水平。

呼吸功能检测参照文献［6］，采用Buxco无创肺功能仪（美国Buxco公司）检测小鼠的呼吸功能，包括潮气量（tidal volume，TV）、每分通气量（minute ventilation，MV）、呼气时间（expiratory time，Te）、吸气时间（inspiratory time，Ti）、PIF和PEF。之后以1.5 g/kg乌拉坦腹腔注射麻醉小鼠，颈部正中纵向切口3 cm，分离气管和食道。在近喉部将气管作横向切口，插入连接有三通开关的2.5 mm气管导管，用于测定TV和流率（V），TV和V用Kent呼吸流量测定仪（美国Kent Scientific Corporation公司）测定。胸内压（intrapleural pressure，IPP）用食道内压代替，将食道作横向切口，插入头端有4个侧孔的注水导管，后联PT14MX型压力换能器（上海嘉龙教学仪器厂），经SMUP-B型生物信号处理系统（复旦大学基础医学院生理与病理生理学系）处理后，TV和V经A/D转换，进入PC计算机，由呼吸检测系统PRC1.00软件（上海嘉龙教学仪器厂）自动记录TV、V和IPP曲线，并自动计算肺动态顺应性（dynamic lung compliance，C）和气道阻力（airway resistance，R）。

肺组织形态学检查对各组小鼠肺组织做常规石蜡切片、HE染色，采用Takao法进行病理学评分。将各个评分进行汇总，总分即代表肺损伤的程度［7］。

小鼠W/D测定游离小鼠肺组织后，肺组织称湿重（W）后置于60℃温箱，72 h后（至恒重）再称干重（D），计算湿/干重比（W/D），可反映肺水肿程度。

BALF内白细胞总数计数，总蛋白浓度定量以及PAI-1浓度检测对小鼠进行肺泡灌洗，吸取20μL BALF在细胞计数板上计数白细胞总数（若BALF中有较多红细胞，先用红细胞裂解液处理，以除去红细胞），剩余样本按照说明书用BCA法进行总蛋白定量以及PAI-1浓度检测。

统计学处理Graphpad 5.0软件对所有数据进行统计处理，计量资料数据以±s表示，差异显著性采用双侧t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

Ⅱ型肺泡细胞Tfpi-1敲除小鼠的构建、表型观察及基因型鉴定通过表型观察，Ⅱ型肺泡细胞中敲除Tfpi-1基因的小鼠与同窝对照组相比，在存活、发育及可育性方面的差异均无统计学意义（图1）。

免疫组化及荧光定量PCR检测免疫组化结果显示TFPI-1在小鼠肺组织内表达丰富，包括Ⅱ型肺泡细胞和Ⅰ型肺泡细胞，相较于 WT组小鼠，KO组小鼠肺组织中TFPI-1表达阳性的Ⅱ型肺泡细胞数量显著减少（图2）。

图1 组织特异性的打靶和基因型鉴定Fig 1 Tissuc spceifie gcnc targcting and gcnotyping

图2 TFPI-1在KO小鼠和WT小鼠肺组织中的表达情况Fig 2 Thc cxprcssion of TFPI-1 in thc lung of KO miec and WT miec

小鼠呼吸功能检测LPS未干预时，WT组和KO组小鼠呼吸功能的差异无统计学意义。LPS气管灌注24 h后，两组小鼠呼吸功能之间的差异仍然无统计学意义，但KO小鼠相对于WT小鼠，TV、MV、C有降低趋势，而Te、R有升高趋势（图3）。

小鼠肺组织结构检查，肺损伤指标以及肺泡内凝血纤溶指标检测LPS未干预时，各组小鼠在肺部结构上未见明显差异；LPS干预后，两组小鼠肺泡腔内可见红细胞和白细胞浸润，巨噬细胞增多，肺泡隔明显增厚，血管充血，间质水肿，整个肺组织出现炎性反应并伴有透明膜形成，而KO组小鼠相较于WT组小鼠，这种变化更加明显（图4）。

图3 小鼠呼吸功能检测Fig 3 Thc tcst of rcspiratory funetion in miec

图4 ALI状态下KO小鼠的肺泡腔内白细胞浸润（主要为中性粒细胞）更为明显Fig 4 In thc statc of ALI，KO miec has morc lcukoeytc infiltration（mainly ncutrophils）in alvcolar spaec

讨 论

Huang等［8］曾经制备了TFPI-1结构域1基因敲除小鼠，但纯合小鼠因卵黄囊出血、脑出血和胎盘发育异常而导致胚胎致死，因此无法将其用于肺发育和肺损伤的评价。基于这种现状，我们和上海南方模式动物中心合作，成功制备了Tfpi-1flox/flox小鼠，再与Spa-Cre小鼠杂交获得了Ⅱ型肺泡细胞条件敲除Tfpi-1基因的小鼠。免疫组化和荧光定量PCR检测发现，在蛋白水平和RNA水平，KO组小鼠相较于WT组，TFPI-1均有明显下降，因此具备了评价TFPI-1在肺发育和肺损伤中是否发挥作用的基础。

TF是外源性凝血途径的启动因子。ALI发生时，肺泡细胞、间质细胞和血管内皮细胞受损，一方面血液循环中的血细胞和凝血因子渗透到肺泡中，另一方面释放大量TF，导致在肺泡中发生凝血反应，最终可形成透明膜，引起急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrom，ARDS）［9-10］。Bastarache等［11］发现，ALI和ARDS患者肺水肿液中TFPI-1水平显著高于血浆。本课题组之前的研究也发现，肺组织中TF在LPS处理6 h后开始上升，在12 h时达到高峰；TFPI-1则在LPS处理后呈下降趋势，在10 h时达到最低值，24 h后仍未回到正常水平［12］。Agrawal等［13］发现，TFPI-1可通过抑制TF活性、降低炎性因子释放，从而减轻内毒素引起的肺损伤。并且有研究发现体外培养的人肺泡上皮来源的A549细胞和原代分离的人Ⅱ型肺泡细胞在炎性因子的刺激下能释放TFPI-1［9-11］，提示肺泡细胞在维持肺泡内TF-TFPI-1平衡以及ALI时肺泡内凝血和纤溶状态的平衡中发挥了重要的调节作用。

有关呼吸功能的研究结果显示，LPS诱导小鼠ALI前后Tv和Mv明显下降，提示ALI时肺顺应性降低，部分肺泡闭塞以及肺水肿导致肺通气功能下降。在生理状态下，KO组小鼠和WT组小鼠的肺功能差异无统计学意义。建立ALI模型后，两种小鼠的呼吸功能差异虽然无统计学意义，但KO组小鼠TV、MV和C有明显的下降趋势，R有明显的上升趋势。

生理情况下Ⅱ型肺泡细胞缺乏TFPI-1时，小鼠肺部的结构与功能未见变化。在LPS诱导建立的ALI模型中，Ⅱ型肺泡细胞缺乏TFPI-1的小鼠肺泡腔内中性粒细胞浸润明显增多，血管充血更加严重，肺泡间隔明显增厚，肺损伤分数、W/D以及BALF中的总白细胞计数显著升高，透明膜形成显著增多，提示在ALI的过程中Ⅱ型肺泡细胞分泌的TFPI-1能够发挥比较显著的抗凝和抗炎作用，从而有助于减轻肺损伤。同时，我们关注了肺泡内PAI-1的变化，发现KO组小鼠相对于WT组小鼠，肺泡内的PAI-1水平显著下降，提示KO组小鼠的肺组织内纤溶活性代偿性的上升，以维持肺泡内凝血与纤溶的平衡。

总之，本研究的结果初步显示，在急性肺部炎症时，Ⅱ型肺泡细胞产生的TFPI-1可以通过改变肺泡内TF-TFPI-1平衡，影响肺泡内的炎症和凝血平衡，进而促进炎症的发生和发展，同时影响小鼠的呼吸功能。目前有关TFPI-1在细胞膜上的受体尚不明确，TFPI-1作为一种抗凝分子，可通过与FXa/ TF/FVIIa结合形成一种四元复合物，抑制血栓的形成，而其中的TF是一种跨膜分子，在此过程中可通过PAR对ERK通路产生抑制作用，但是否有抑制P38途径的作用目前还存在争议［14］；另有报道TFPI-1可以与SDC4相互结合向细胞内传递信号［15-16］，对于TFPI-1减少加重肺部炎症的机制尚有待于进一步的研究。

致谢王际平和温丹萍在小鼠繁殖、基因型鉴定技术以及文献分享上给予了指导和帮助；肖家军、许飞、刁磊和徐君在免疫组化实验上给予了帮助；房波在real-time PCR实验上给予了帮助；张志刚老师在小鼠肺部病理检查上给予了指导与帮助；王琴、宋元林老师和高磊老师在小鼠ALI模型建立以及肺损伤指标检测技术上给予了指导和帮助；上海市针灸筋络研究所的王宇老师和马子风在小鼠呼吸功能检测上给予了帮助。

［1］ Raghavendran K，Pryhuber GS，Chess PR，et al. Pharmacotherapy of acute lung injury and acuterespiratory distress syndrome［J］.Curr Med Chem，2008，15（19）：1911-1924.

［2］ Ellery PE，Adams MJ.Tissue factor pathway inhibitor：then and now［J］.Semin Thromb Hemost，2014，40（8）：881-886.

［3］ Kereveur A，Enjyoji K，Masuda K，et al.Production of tissue factor pathway inhibitor in cardiomyocytes and itsupregulation by interleukin-1［J］.Thromb Haemost，2001，86（5）：1314-1319.

［4］ 时令，王友亮，程萱，等.表面活性蛋白A启动子指导Cre重组酶在转基因小鼠Ⅱ型肺上皮细胞中表达［J］.生物技术通讯，2005，16（5）：482-484.

［5］ Su X，Johansen M，Looney MR，et al.CD47 deficiency protects mice from lipopolysaccharide-induced acute lung injury and Escherichia coli pneumonia［J］.J Immunol，2008，180（10）：6947.6953.

［6］ Card JW，Carey MA，Bradbury JA，et al.Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation［J］.J Immunol，2008，177（1）：621-630.

［7］ Ginsberg HS，Horswood RL，Chanock RM，et al.Role of early genes in pathogenesis of adenovirus pneumonia［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，1990，87（16）：6191-6195.

［8］ Huang ZF，Higuchi D，Lasky N，et al.Tissue factor pathway inhibitor gene disruption produces intrauterine lethality in mice［J］.Blood，1997，90（3）：944-951.

［9］ Bastarache JA，Wang L，Geiser T，et al.The alveolar epithelium can initiate the extrinsic coagulation cascade through expression of tissue factor［J］.Thorax，2007，62 （7）：608-616.

［10］ van der Poll T.Tissue factor as an initiator of coagulation and inflammation in the lung［J］.Critical care，2008，12 （Supple 6）：S3.

［11］ Bastarache JA，Wang L，Wang Z，et al.Intra-alveolar tissue factor pathway inhibitor is not sufficient to block tissue factor procoagulant activity［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，294（5）：L874-L881.

［12］ Li Z，Mao Z，Lin Y，et al.Dynamic changes of tissue factor pathway inhibitor type 2 associated with IL-1βand TNF-αin the development of murine acute lung injury ［J］.Thromb Res，2008，123（2）：361-366.

［13］ Agrawal P，Thakur Z，Kulharia M.Homology modeling and structural validation of tissue factor pathway inhibitor ［J］.Bioinformation，2013，9（16）：808-812.

［14］ Camerer E，Huang W，Coughlin SR.Tissue factor and factor X-dependent activation of protease-activated receptor 2 by factor VIIa［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97（10）：5255-5260.

［15］ Petersen LC，Thastrup O，Hagel G，et al.Exclusion of known protease-activated receptors in factorⅦa-induced signal transduction［J］.Thromb Haemost，2000，83（4）：571-576.

［16］ Kojima T，Katsumi A，Yamazaki T，et al.Human ryudocan from endothelium-like cells binds basic fibroblast growth factor，midkine，and tissue factor pathway inhibitor［J］.J Biol Chem，1996，271（10）：5914-5920.

Effcet of eonditional knoekout of Tfpi-1 gcnc in typcⅡpncumoeytcs on lipopolysaeeharidcs-induecd aeutc lung injury in miec

WU Xie1，WANG Bao-qing2，ZHANG Jin1，JIANG Nan1，WANG Hui-jun3，MA Duan1，3△
（1Key Laboratory of Metabolism and Molecular Medicine，Ministry of Education，School of Basic Medical Sciences，Fudan University，Shanghai 200032，China；2Department of Respiration，Zhongshan Hospital，Fudan University，
Shanghai 200032，China；3Research Center for Children Development and Translational Medicine，
Children's Hospital，Fudan University，Shanghai 201102，China）

E-mail：duanma@fudan.edu.cn

R 34；R 563

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.06.001

2015-06-25；编辑：段佳）

国家自然科学基金（81070104）△

*This work was supportcd by thc National Natural Seicnec Foundation of China（81070104）.