崔嘉真黄建胜朱乃硕△

（1复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室，2微生物感染与免疫实验室 上海 200438；3复旦大学生物医学研究院 上海 200032）

产KPC酶超耐药阿斯肠杆菌Eah7的发现及其耐药伴生质粒的遗传特征

崔嘉真1，2，3黄建胜1，2，3朱乃硕1，2，3△

（1复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室，2微生物感染与免疫实验室 上海 200438；3复旦大学生物医学研究院 上海 200032）

目的 分析1株亚胺培南抗性阿斯肠杆菌（Enterobacter asburiae）的耐药机制及其遗传特征。方法Vitek-2 Compact系统初步鉴定菌株并测定抗生素最小抑菌浓度，对16s rRNA基因测序以确定菌株；PCR法扩增β-内酰胺类、喹诺酮类和氨基糖苷类等17种耐药基因并测序确认；以CaCl2诱导的化学法转化质粒；构建伴生质粒DNA文库并测序，以Glimmer 3.02和BLASTP软件注释并预测伴生质粒序列的编码基因功能；采用接合试验验证伴生质粒对耐药性质粒转移的作用。结果该菌株为阿斯肠杆菌，对亚胺培南等15种β-内酰胺及氨基糖苷类抗生素耐药，仅对左氧氟沙星和环丙沙星敏感；该菌株同时含有2种质粒，其中耐药性质粒p Ea-1携带耐药基因blaKPC-2、blaCTX-M-15和blaTEM-1，而伴生质粒p Ea-2则携带4种转移蛋白基因mob A、mob B、mob C和mob D；p Ea-2可促进耐药质粒pEa-1接合转移。结论在国内首次报道了产KPC-2酶的阿斯肠杆菌，该菌携带的质粒p Ea-2具有促进耐药性质粒p Ea-1接合转移的作用。

阿斯肠杆菌； 耐药质粒； 伴生质粒

【Abstraet】 Objcetivc To analyze the drug-resistant mechanism and genetic characteristics of a strain of imipenem-resistant Enterobacter asburiae. Mcthods The strain and its antibiotics minimum inhibitory concentration was identified by Vitek-2 Compact System，then it was determined by sequencing its 16s r RNA gene.Seventeen genes includingβ-lactamase resistance gene，quinolone resistance gene and aminoglycoside resistance gene were detected by PCR method and confirmed by sequencing.The plasmid of Enterobacter asburiae was transformed by CaCl2-induced chemical method.

Associated plasmid DNA library was constructed and sequenced.We annotated and predicted encoding function of the associated plasmid by Glimmer 3.02 and BLASTP.The role of the associated small plasmid on transferring to the drug-resistant plasmid was verified by conjugation. Rcsults This strain belonged to Enterobacter asburiae.It was resistant to 15 kinds ofβ-lactam antibiotics，such as imipenem and aminoglycoside antibiotics，but it was sensitive to levofloxacin and ciprofloxacin.This strain contained kinds of plasmids.The drug-resistant plasmid p Ea-1 carried resistance genes blaKPC-2，blaCTX-M-15and blaTEM-1，while the associated plasmid p Ea-2 carried 4 mobilization proteins genes called mob A，mob B，mob C and mob D.pEa-2 might promote the conjugation of drug-resistant plasmid p Ea-1. Conelusions It is the first time to report that a strain of Enterobacter asburiae can produce KPC-2 enzyme in China，and plasmid p Ea-2 carried by the strain might promote the conjugation of drugresistant plasmid pEa-1.

【Kcy words】 Enterobacter asburiae； drug-resistant plasmid； associated plasmid

*This work was supportcd by thc National Seicnec and Tcehnology Major Projcet（2012ZX10002006-002-003），863 Biologieal Mcdieinc high-tceh Projcet（2011AA02A114），Seicnec Fund of Shanghai Seicnec and Tcehnology Commission（13431900602）and thc National Natural Seicnec Foundation of China（30571650，31370927）.

近年来，由于抗生素的过度使用，病原菌在选择压力下不断获得新的耐药基因而形成超级耐药菌，已成为人类生存的重大威胁。β-内酰胺类抗生素是目前临床抗感染常用药物。病原菌表达的超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamase，ESBL）主要包括TEM、SHV、CTX-M、可水解青霉素类抗生素、头孢菌素和单环类β-内酰胺类抗生素［1］。亚胺培南、美洛培南及厄他培南等碳青霉烯类抗生素是治疗革兰阴性菌引起的重症感染的一线药物，也是治疗产ESBL菌感染的最后的有效药物［1］。然而，碳青霉烯酶能够水解包括碳青霉烯类抗生素在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素［2］。KPC酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase）属于A类碳青霉烯酶，其编码基因blaKPC大多位于质粒上，可在菌株间迅速传播，对临床抗感染治疗产生严重威胁［1-2］。自2001年Yigit等［3］首次在肺炎克雷伯菌中发现blaKPC基因以来，已报道blaKPC-2～blaKPC-15共14种亚型（blaKPC-1和blaKPC-2相同［4］），且产KPC酶的耐药菌也呈全球扩散趋势［5］。

阿斯肠杆菌（Enterobacter asburiae）属于革兰阴性肠杆菌，为机会感染菌，通常不致病。我们在进行院内感染耐药菌群研究时发现1株超耐药性阿斯肠杆菌。该菌含有耐药基因blaTEM-1、blaCTX-M-15及blaKPC-2，且位于同一质粒p Ea-1上；同时携带一伴生小质粒p Ea-2，大小为3 788 bp。本研究旨在对临床分离的超耐药阿斯肠杆菌Ea H7株的特性及其所含的2种质粒的结构特征、基因序列、协同关系及可能的伴生机制进行分析和研究。

材料和方法

菌株来源阿斯肠杆菌Ea H7分离自浙江省丽水市中心医院住院患者，大肠埃希菌J53AzR（AMPsNa N3r）由本实验室保藏，Trans1-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。大肠埃希菌V517［6］由复旦大学附属华山医院王明贵教授惠赠。

主要仪器及试剂Vitek-2 Compact全自动细菌分析鉴定系统、AST-GN13药敏卡（美国Bio Mérieux公司），Veriti®PCR仪（品牌：Applied Biosystems）及3730XI DNA Analyzer（48）测序仪（美国Life Technologies公司），AxyPrep质粒DNA抽提试剂盒（美国Axygen公司），p EASYTM-T5 Zero克隆载体（北京全式金生物技术有限公司），Sac I、Kpn I限制性内切酶（日本TaKaRa公司）等。

菌株鉴定按操作说明以Vitek-2 Compact系统初步鉴定菌株。然后以通用引物1492R和27FHT扩增其16s r RNA基因并测序，最终鉴定其菌种。

药敏试验采用Vitek-2 Compact系统ASTGN13药敏卡测定18种临床常用抗生素最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）值，包括氨苄西林、舒巴坦、阿米卡星、氨曲南、甲氧苄氨嘧啶、头孢替坦、头孢曲松、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢他啶、庆大霉素、呋喃妥因、妥布霉素、亚胺培南、厄他培南、哌拉西林、左氧氟沙星和环丙沙星。根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）2012年标准读取结果，以大肠埃希菌ATCC25922为质控对照。

耐药基因检测PCR法检测以下β-内酰胺酶类blaKPC、blaVIM、blaIMP、blaSIM、blaGIM、blaSPM、blaOXA、blaTEM、blaSHV、blaCTX-M，喹诺酮类qnr A、qnrB、qnrC、qnr D、qnrS、qep A及氨基糖苷类aac （6'）-Ib-cr共17种耐药基因。引物如前述［7］，PCR参数设置：94℃变性3 min；然后94℃下30 s，55℃下30 s，72℃下60 s，循环30次；最后72℃延伸5 min。以实验室保存的臭鼻克雷伯菌Ko6 （blaKPC）、肺炎克雷伯菌（blaIMP）、铜绿假单胞菌（blaVIM）及鲍曼不动杆菌（blaOXA）为阳性对照。

质粒抽提及转化按照操作说明以Axy Prep质粒DNA抽提试剂盒抽提质粒；以CaCl2诱导的化学法［7］转化感受态细胞Trans1-T1，用含氨苄青霉素100μg/m L的LB固体培养基筛选转化子。

小质粒DNA文库构建及测序分析按照操作说明以Sac I和Kpn I酶切质粒，并将酶切产物克隆至p EASYTM-T5 Zero载体。按照说明书用M13引物（p EASYTM-T5 Zero载体试剂盒提供）进行PCR鉴定重组子，产物送铂尚生物公司测序之后进行BLAST对比分析，根据测序结果设计新的引物，采用步移法测通全质粒。以Glimmer 3.02和BLASTP软件注释并预测其功能。

接合实验以大肠埃希菌J53AzR（AMPsNa）为受体菌，分别以阿斯肠杆菌Ea H7和耐药质粒转化子EEa为供体菌进行接合实验［8］。分别取Ea H7、EEa及J53单菌落少许，接种至5 m L LB液体培养基中，37℃摇床培养6 h，取Ea H7 0.5 m L +J53菌悬液0.5 m L和EEa 0.5 m L+J53菌悬液0.5 m L分别加至4 m L新鲜LB液体培养基中，37℃静态过夜培养。MH固体筛选培养基中叠氮化钠及氨苄青霉素筛选浓度分别为110μg/m L和100μg/m L。重复实验5次，挑单菌落，测其16s r RNA基因以排除假阳性接合子。

结 果

菌株鉴定该菌经Vitek-2 Compact系统鉴定为阿斯肠杆菌，其16s r RNA基因序列与标准阿斯肠杆菌LF7a菌株（NR_074722.1）99％一致，因此确定该菌株为阿斯肠杆菌，命名为Ea H7。

Eah7耐药性Ea H7对多种抗生素耐药，包括氨苄西林、舒巴坦、阿米卡星、氨曲南、甲氧苄氨嘧啶、头孢替坦、头孢曲松、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢他啶、庆大霉素、呋喃妥因、妥布霉素、亚胺培南、厄他培南、哌拉西林等；Ea H17仅对左氧氟沙星和环丙沙星敏感（表1）。

表1 Eah7对多种抗生素药敏实验结果Tab 1 Drug scnsitivity assay of Eah7 against various of antimierobials

耐药基因检测经PCR检测blaKPC、blaTEM及blaCTX-M3种基因扩增呈阳性，经BLAST比对，三者分别与blaKPC-2（GenBank编号：FJ628167.2）、blaTEM-1（GenBank编号：HM131427.1）及blaCTX-M-15（GenBank编号：KF155155.1）序列100％一致。其余耐药基因blaVIM、blaIMP、blaSIM、blaGIM、blaSPM、blaOXA、blaSHV、qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qep A、aac（6'）-Ib-cr等共14种PCR扩增均呈阴性。

质粒分析Ea H7菌株质粒电泳结果可见在54 kb及3.9 kb处均有一质粒条带，分别命名为p Ea-1 和p Ea-2（图1）。将Ea H7菌株质粒转化感受态细胞Trans1-T1，抽提质粒。转化实验得到只含有p Ea-1的转化子EEa。

接合实验以Ea H7为供体菌，J53为受体菌，经筛选共挑取25个单菌落，测其16s rRNA基因，结果有10个阳性接合子，并且只有pEa-1转移至J53中，抽提接合子（命名JEa）质粒（图1）；而以转化子EEa为供体菌，J53为受体菌，经筛选，无接合子生长。

图1 Eah7、EEa和JEa抽提质粒电泳图Fig 1 Plasmid cxtraetion clcetrophorcgram of Eah7，EEa and JEa

blaKPC-2基因结构分析blaKPC-2基因及其两侧测序长14 091 bp，经BLAST对比分析其与GenBank CP006657.1相似度达99％。blaKPC-2周围同样由Tn3、部分Tn4401及Tn1721构成（图2）。Tn4401由Tn4401转座酶、Tn4401解离酶、blaKPC-2、IS Kpn6、IS Kpn7组成，是美国、希腊等地区常见携带blaKPC-2的可移动元件［9］。p Ea-1中只有长度为2 070 bp，包括blaKPC-2及类似IS Kpn6的片段与Nass等［9］报道的Tn4401相似。

测序发现在blaKPC-2基因上游存在一个Tn3转座子，以两端38 bp的反向重复（inverted repeat，IR）序列和3 bp的插入位点重复TSD（TAA）为界，由Tn3转座酶、Tn3解离酶和插入序列IS Kpn8组成。其中IS Kpn8属于IS481家族，形成6 bp的TSD（ATAGGT）。在blaKPC-2基因下游还发现另外1个转座子Tn1721，它以两端的反向重复序列IRL 和IRR为界，由Tn1721转座酶和Tn1721解离酶组成。

pEa-2序列特征p Ea-2测序全长3 788 bp，有6个编码序列（coding sequence，CDS），分别编码4种转移蛋白Mob A、MobB、MobC和MobD，DNA复制蛋白及DUF304结构域，并存在复制起始区rep-origin、转移起始区ori T、转移基点区bom （basis of mobility）等（图3）。然而，pEa-2不携带耐药性相关基因。

图2 blaKPC-2遗传结构图Fig 2 Thc gcnctie strueturc of blaKPC-2

图3 阿斯肠杆菌Eah7质粒pEa-2图谱Fig 3 Atlas of thc plasmid pEa-2 of Eah7

p Ea-2属于RNA调控的复制子，复制起始区包含RNAⅡ和RNAⅠ。RNAⅡ是复制起始的引物，RNAⅠ（即反义RNA分子）能与RNAⅡ相互作用，抑制引物的形成［10-11］。RNAⅡ和RNAⅠ区域位于复制起始的上游，有各自的-10和-35序列，并且高度保守［10-11］。p Ea-2与质粒ColE1（GenBank编号：J01566）、p RK10（GenBank编号：EU697813）和pSW200（GenBank编号：L42525）的RNAⅡ、RNAⅠ及各自的-10和-35序列对比见图4。bom区（与Genebank JX457478.1有80％相似）覆盖ori T区，位于4种转移蛋白上游，是质粒转移所需的顺式作用元件。p Ea-2与ColE1、pSW200、p RK10质粒转移蛋白基因相似度对比见表2。

图4 p Ea-2、ColE1、p RK10和pSW200部分复制起始区多序列对比图Fig 4 Multiplc scqucnec alignmcnt of partial rcplieaionorigin of pEa-2，ColE1，pRK10 and pSW200

表2 pEa-2与ColE1、pSW200、pRK10质粒转移蛋白基因相似度对比Tab 2 Comparison of gcnc of mobilization protcins with ColE1，pSW200 and p RK10 to p Ea-2

讨 论

阿斯肠杆菌对β-内酰胺类抗生素天然不耐药，本研究发现的阿斯肠杆菌Ea H7是临床混合感染肺炎克雷伯菌［7］标本中分离到的，对15种β-内酰胺类耐药或中等耐药，尤其是对亚胺培南及厄他培南具有耐药性（MIC分别为≥16及≥8μg/mL）。PCR检测β-内酰胺类、喹诺酮类和氨基糖苷类等17种耐药基因，发现其含有ESBL抗性基因blaTEM-1、blaCTX-M-15及碳青霉烯酶基因blaKPC-2，且位于同一质粒pEa-1上，3种基因可能是导致EaH7产生超耐药性的主要原因。

KPC型碳青霉烯酶基因常见于肺炎克雷伯菌中，在肠杆菌属中较少见，在阿斯肠杆菌中更为少见。Hossain等［12］于2004年首次报道了1株由质粒介导的含有KPC基因的肠杆菌属菌株；Mathers等［13］于2011年首次报道1株能合成碳青霉烯酶的阿斯肠杆菌。国内尚未见报道。

而Ea H7同时携带的另一小质粒p Ea-2不携带耐药基因，但是携带4种转移蛋白Mob A、MobB、MobC和MobD。这4种转移蛋白被认为是接合作用中介导基因水平转移所必需的［14-15］，转移蛋白结合相关辅助蛋白，形成1个松弛体，以特定的方式切割双链DNA。转移蛋白Mob A结合MobB和MobC，切割质粒同一条链的GC位点，然后结合到DNA链的5＇端，进而转移质粒，Mob A还参与转移的终止［14］。Mob D也参与质粒的转移，但具体功能不详［14］。Bravo-Angel等［15］将含有Mob A和ori T区的一种改造质粒p Mob和另一种含有T-DNA和ori T的质粒（能够与p Mob共存）共转移到土壤农杆菌中，然后转染植物细胞，检测植物细胞中的TDNA含量，证明了Mob A的促进转移及整合功能，并同时说明了Mob A可以转移含有与自身质粒相同ori T区的质粒。另外，Dery等［11］将pJHCMW1质粒上含有ori T区的片段克隆至p ROXT1质粒上并转化大肠埃希菌DH5a，得到转化子大肠埃希菌DH5a（p ROXT1）。在接合实验中，只有同时加入含有转移蛋白Mob基因的大肠埃希菌DH5a （p RK2073）时，p ROXT1才能转移至受体菌中，同样证明了Mob基因的促进转移功能。本研究在进行接合试验时，只有耐药质粒p Ea-1能够转移至受体菌，而将只含有p Ea-1的转化子EEa接合到受体菌时并未得到接合子，推测p Ea-1可借助p Ea-2编码的转移蛋白Mob A、MobB、MobC和Mob D进行接合转移。

对于blaKPC类新型的耐药基因，从发现到普遍存在于各种致病菌中只有十几年时间，耐药基因的水平转移是其快速分布的原因，其中接合作用便是其方式之一［16］。本研究发现1株超耐药阿斯肠杆菌，耐药基因blaTEM-1、blaCTX-M-15及blaKPC-2均位于p Ea-1上，而其携带的另一小质粒p Ea-2具有促进耐药性质粒p Ea-1接合转移的作用。我们将进一步通过基因敲除等方法明确伴生小质粒促进耐药性质粒接合转移的机制。

［1］ 张剑，杜英姿，王能一，等.ESBLs的研究进展［J］.医学检验与临床，2008，19（2）：80-82.

［2］ Canton R，Akova M，Carmeli Y，et al.Rapid evolution and spread of carbapenemases among Enterobacteriaceae in Europe［J］.Clin Microbiol Infect，2012，18（5）：413-431.

［3］ Yigit H，Queenan AM，Anderson GJ，et al.Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase，KPC-1，from a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumoniae［J］. Antimicrob Agents Chemother，2001，45（4）：1151-1161.

［4］ Yigit H，Queenan AM，Anderson GJ，et al.Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase，KPC-1，from a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumoniae（vol 45，pg 1151，2001）［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52（2）：809.

［5］ 纪明宇，耿大影，裴凤艳，等.KPC型碳青霉烯酶研究概况及进展［J］.临床检验杂志，2013，31（4）：282-285.

［6］ 王明贵，Tran JH，Jacoby GA，等.大肠埃希菌临床分离株对喹诺酮类抗菌药的质粒介导耐药［J］.中国感染与化疗杂志，2006，6（4）：217-221.

［7］ Huang J，Li X，Zhu N，et al.Genetic characteristics of one highly multi-drug-resistant strain of Klebsiella ozaenae ［J］.J Med Microbiol，2012，61（9）：1303-1305.

［8］ Wang MG，Tran JH，Jacoby GA，et al.Plasmid-mediated quinolone resistance in clinical isolates of Escherichia coli from Shanghai，China［J］.Antimicrob Agents Chemother，2003，47（7）：2242-2248.

［9］ Naas T，Cuzon G，Villegas M，et al.Genetic structures at the origin of acquisition of the beta-lactamase blaKPCgene ［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52（4）：1257 -1263.

［10］ Selzer G，Som T，Itoh T，et al.The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids［J］.Cell，1983，32（1）：119-129.

［11］ Dery KJ，Chavideh R，Waters V，et al.Characterization of the replication and mobilization regions of the multiresistance Klebsiella pneumonia plasmid pJHCMW1［J］.Plasmid，1997，38（2）：97-105.

［12］ Hossain A，Ferraro MJ，Pino RM，et al.Plasmid-mediated carbapenem-hydrolyzing enzyme KPC-2 in an Enterobacter sp［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48（11）：4438-4440.

［13］ Mathers AJ，Cox HL，Kitchel B，et al.Molecular dissection of an outbreak of carbapenem-resistant enterobacteriaceae reveals intergenus KPC carbapenemase transmission through a promiscuous plasmid［J］.MBio，2011，2（6）：e00204-e00211.

［14］ Syed Ibrahim K，Bakkiyaraj D，James R，et al.Isolation and sequence analysis of a small cryptic plasmid p RK10 from a corrosion inhibitor degrading strain Serratia marcescens ACE2［J］.Plasmid，2009，62（3）：183-190.

［15］ Bravo-Angel AM，Gloeckler V，Hohn B，et al.Bacterial conjugation protein Mob A mediates integration of complex DNA structures into plant cells［J］.J Bacteriol，1999，181 （18）：5758-5765.

［16］ Seitz P，Blokesch M.Cues and regulatory pathways involved in natural competence and transformation in pathogenic and environmental Gram-negative bacteria［J］. FEMS Microbiol Rev，2013，37（3）：336-363.

Dctcetion of a strain of ultra-drug-rcsistant Enterobacter asburiae eallcd Eah7 produeing KPC cnzymc and thc gcnctie eharaetcristies of its rcsistant-assoeiatcd plasmid

CUI Jia-zhen1，2，3，HUANG Jian-sheng1，2，3，ZHU Nai-shuo1，2，3△
（1State Key Laboratory of Genetic Engineering，2Laboratory of Microbial Infection and Immunity，
School of Life Sciences，Fudan University，Shanghai 200438，China；3Institute of Biomedical Science，Fudan University，Shanghai 200032，China）

Q 933

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.06.003

2015-03-27；编辑： 段佳）

国家科技重大专项（2012ZX10002006-002-003）；863生物医药高科技课题（2011AA02A114）；上海市科委科学基金（13431900602）；国家自然科学基金（30571650，31370927）

△Corresponding author E-mail：nzhu@fudan.edu.cn