梁跃东 杨兴林 洪章萍 熊金凤 黄海

（1.贵阳市第五人民医院，贵州 贵阳550004；2.贵阳医学院检验系，贵州 贵阳550004）

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染后约80%发展为慢性肝炎，约25%发展为肝硬化、肝癌［1］。引起丙肝慢性化的重要原因之一是宿主免疫功能的变化，其中T淋巴细胞及其所分泌的细胞因子的变化显著影响了感染的进程。因此了解近年来贵州地区 HCV流行株的基因型，了解HCV感染过程中T淋巴细胞及其细胞因子的变化，对临床治疗具有指导意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择贵阳市第五人民医院2011年10月至2013年7月传染科门诊和住院患者中HCV RNA为阳性的慢性丙肝患者198例，其中男109例，女89例，年龄20～74岁；诊断均符合2004年中华医学会肝病学分会、中华医学会传染病与寄生虫病学分会《丙型肝炎防治方案》，所有患者的抗－HCV检测为阳性，且排除其他类型肝炎病毒感染，均未使用过干扰素和其他免疫调节剂。45例健康对照标本来自本院健康体检人群。

1.2 HCV－RNA定量检测 采用实时荧光定量（RQ－PCR）法，采用上海科华股份有限公司生产的HCV荧光定量PCR试剂盒检测，灵敏度为5×102IU／mL。

1.3 HCV基因分型 用异硫氰酸胍（Trizol）－氯仿－异丙醇抽提血清中的HCV RNA，用75%的乙醇洗涤RNA沉淀，15μL DEPC水溶解核酸－70℃保存或立即冰浴备用。依据HCV Core－E1区核苷酸序列合成4条引物，引物由上海生工生物技术有限公司合成。引物序列为：CEI－ESP 5’－GCAACAGGGAACCTTCCTGGTTGCTC－3’，CEI－EAP 5’－CGTAGGGGACCAGTTCATCATCAT－3’，CEI－ISP 5’－AACCTTCCTGGTTGCTCTTTCTCTAT－3’，CEI－IAP 5’－GT－TCATCATCATATCCCATGCCAT－3’。逆转录及首轮PCR同时进行，逆转录反应条件为：42℃40min；94℃15s，60℃15s，72℃30s，共扩增30个循环；72℃延伸5min，得到外扩增PCR产物。取2μL为模板，进行第2轮PCR反应，PCR循环参数与首轮相同，得到内扩增PCR产物，扩增片段为474bp。PCR产物置1.5%的琼脂糖电泳20min，凝胶成像分析仪观察结果。取阳性PCR产物，用Promega的PCR DNA纯化体系进行纯化，送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，CEl－ISP作为测序引物。

1.4 细 胞 因 子 检 测 血 清IL－2、IL－8、IL－10 和TFN－α检测采用ELISA法，试剂盒购自生物晶美工程有限公司，按试剂盒说明方法进行检测。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，年龄、血清细胞因子水平数据用t检验，以（¯x±s）表示，性别资料用χ2检验，不同基因型细胞因子水平比较用F检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 198份丙型肝炎患者HCV基因分型 结果显示，1a型4例（2.02%），1b 型71例（35.86%），2a型9例（4.55%），3a型29例（14.65%），3b型47例（23.74%），6a 型 37 例 （18.69%），6d 型 1 例（0.50%）。

2.2 慢性丙型肝炎患者血清细胞因子水平与正常对照组的比较 198例慢性丙型肝炎患者血清细胞因子水平与正常对照组比较结果见表1，血清IL－8与正常对照组比较差异无统计学意义，而慢性丙型肝炎患者血清IL－2、IL－10、TNF－α与正常对照组比较差异均有统计学意义。

表1 慢性丙型肝炎患者血清细胞因子水平与正常对照组比较 （pg／mL）

2.3 慢性丙型肝炎患者不同基因型细胞因子水平比较 184例不同基因型之间细胞因子水平的结果比较，发现IL－2与TNF－α在各基因型间比较差异无统计学意义。IL－8在lb型患者血清中含量与3a、3b、6a型患者比较差异有统计学意义（P＜0.05），3a、3b、6a型患者血清中IL－8含量两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）；IL－10在lb型患者血清中含量与3a、3b、6a型患者比较差异有统计学意义（P＜0.05），3a、3b、6a型患者血清中IL－10含量两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。1a、2a、6a检测例数较少未进行统计比较。见表2。

表2 丙型肝炎患者不同基因型细胞因子水平比较

3 讨 论

慢性丙肝感染可导致肝硬化、原发性肝癌，但发病机制尚不明确。近来发现，宿主免疫应答在HCV感染的慢性化中，尤其是Th1／Th2相关因子表达失衡在丙型肝炎发病机制中可能起重要作用［2－3］。细胞毒T淋巴细胞（CTL）是主要的效应细胞，激活的CTL细胞通过释放穿孔素和Fas介导的细胞凋亡途径清除病毒，同时导致肝细胞炎症坏死。CTL细胞需在Th细胞辅佐下才能充分发挥作用。Th细胞即辅助性T淋巴细胞，前体Th0细胞可分化为Th1／Th2两个优势亚型，Thl细胞主要分泌IL－2、IL－12、IFN 、TNF等，能促进细胞免疫，对 CTL的功能有辅佐作用；Th2细胞主要分泌IL－4、IL－5、IL－6、IL－10等，对 Th1细胞有抑制作用，它抑制细胞免疫，增强体液免疫，细胞因子水平和Thl／Th2优势亚群两者互相影响，互为因果。Thl细胞有利于病毒的清除而Th2细胞主要与组织损伤及慢性化有关。Thl细胞与Th2细胞之间的活性的平衡决定了感染的结局及临床表现，进而影响HCV感染者的慢性化和临床转归。

本文结果显示，慢性丙型肝炎与正常对照组比较，丙型肝炎患者体内存在Th1型细胞因子分泌IL－2、TNF－α明显降低，Th2型细胞因子分泌IL－10增高，可抑制宿主的细胞免疫功能，使机体不能清除病毒，可能是HCV感染慢性化的重要机制，与相关报道［4－5］相符。分析以上研究结果可知，CHC患者体内Th2类细胞因子均呈高表达状态，Th1类细胞因子表达情况的报道尚不完全一致，可能与收集病例样本有关。本研究也发现IL－2、TNF－α表达较低的现象，CHC患者Th1类细胞因子表达受到抑制，而Th2类细胞因子高表达，可能Th1类细胞因子水平低下是导致机体细胞免疫功能缺陷、使病毒清除障碍及感染慢性化的原因之一。

目前干扰素－a联合利巴韦林（RBV）是公认治疗慢性丙型肝炎有效的药物，能有效抑制患者HCV复制，减轻肝脏炎症坏死和肝纤维化。在治疗前评估、疗效预测及个体化疗程，其中基因型最为重要，目前多数指南推荐基本疗程为：基因1型48周，基因2／3型24周［6］。近年来，相关的研究结果显示，在治疗过程中Thl／Th2类相关因子均有不同的变化，贾红宇等［7］对24例HCV携带者和27例CHC患者血清IL－18和IL－10水平的研究发现，CHC患者该两种细胞因子水平明显高于正常对照组和HCV携带组，27例CHC患者经干扰素－a治疗6个月后IL－18和IL－10水平较治疗前明显降低。血清中IL－10水平由高到低依次为：治疗无应答组＞部分应答组＞完全应答组。胡敏涛等［8］报道用聚乙二醇干扰素a－2b治疗的慢性丙型肝炎患者58例，用双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测治疗前后患者血清INF－r、IL－2、IL－6、IL－10的变化，治疗48周后应答组与无应答组比较，INF－r、IL－2水平均显著升高，IL－6、IL－10水平则显著降低，差异均有统计学意义。慢性丙型肝炎患者血清IL－8含量明显增高，IL－8能降低2’－5寡腺苷合成酶活性，抑制内源性IFN－a的合成，有研究证明，NS5A基因的刺激可使IL－8的合成增加8～12倍，发现非结构蛋白NS3和NS4抗体水平与病毒血症程度无相关性，高水平病毒血症患者的抗－NS5抗体显著增高，说明NS5蛋白是激活HCV复制的重要因子。以上研究结果表明，某些细胞因子，特别是IL－2、IL－10、IL－8、TNF等的水平，可做为CHC预后和预测IFN治疗效果的指标。本实验通过对CHC患者血清IL－2、IL－10、IL－8、TNF－a及基因型检测，结果显示在治疗前CHC患者1b型中外周血IL－8、IL－10明显高于3a、3b、6a型，提示1b型患者抗病毒治疗效果不佳的因素之一。在基因型与细胞因子的关系报道较少，在不同基因型CHC患者抗病毒治疗过程中细胞因子的动态变化正做进一步研究。

总之，丙型肝炎的显著临床特点就是极易慢性化，而T淋巴细胞以及细胞因子在HCV感染慢性化中起着重要作用，Thl／Th2相关细胞因子水平不但与丙型肝炎的慢性化和疾病进程有关，而且与IFN疗效关系密切。HCV基因型对于肝损伤、疾病进展和转归的影响尚有不同观点，不同基因型与HCV感染后的病情变化以及干扰素的疗效有一定相关性。如何能把基因型与相关细胞因子水平的变化在预测丙型肝炎的诊断、治疗和预防，规范检测方法，仍需进一步深入研究。

［1］ Hezode C，Forestier N，Dusheiko G，et al.Telaprevir and peginterferon with or with out ribavirin for chronic HCV infection［J］.N Engl J Med，2009，360（18）：1839－1850.

［2］ 董漪，张鸿飞，陈昊，等.小儿慢性丙型肝炎外周血T细胞亚群和TH1／TH2型细胞因子的研究［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2007，21（1）：26－28.

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［4］ 牛文强.慢性丙型病毒性肝炎患者血清细胞因子水平检测及临床意义［J］.国际检验医学杂志，2012，33（8）：983－984.

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［7］ 贾红宇，盛吉芳，周林福，等.血清IL－18和IL－10在慢性丙型肝炎发病中作用的临床研究［J］.中国感染控制杂志，2006，5（4）：303－305.

［8］ 胡敏涛，毛燕群，裴豪，等.聚乙二醇干扰素治疗丙型肝炎前后淋巴细胞亚群及辅助性T淋巴细胞因子的变化［J］.中国全科医学杂志，2011，14（11）：3829－3832.